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高通量测序技术在尿路感染病原学诊断中的价值

2021-03-09 296 上传者：管理员

摘要：目的比较尿路感染、腹膜透析相关腹膜炎患者采用高通量测序技术、常规培养法对病原体的检出情况,探讨高通量测序技术在尿路感染、腹膜透析相关腹膜炎病原学诊断中的应用价值。方法收集77例尿路感染患者中段尿标本,36例腹膜透析相关腹膜炎患者透析流出液标本,分别应用高通量测序技术、常规培养法进行检测,记录病原体检出率及病原体分布情况,以培养法为金标准,计算高通量测序法对病原体检测的灵敏度。结果77例尿路感染患者中,高通量测序法检出病原体70例(90.9%),共分离出病原体169株;培养法检出病原体27例(35.1%),共分离出病原体27株;以培养法为金标准,高通量测序法对尿路感染患者病原体检出的灵敏度为96.3%。36例腹膜透析相关腹膜炎患者中,高通量测序法检出病原体28例(77.8%),共分离出病原体39株,培养法检出病原体11例(30.6%),共分离出病原体11株;以培养法为金标准,高通量测序法对腹膜透析相关腹膜炎患者病原体检出的灵敏度为72.7%。结论对尿路感染、腹膜透析相关腹膜炎患者,采用高通量测序技术检出的病原体株数多于培养法,可作为培养法的有效补充。

关键词：
培养法
尿路感染
病原体株数
腹膜透析相关腹膜炎
高通量测序技术
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尿路感染(UTI)是最常见的医院获得性感染之一,腹膜透析相关腹膜炎(PDAP)是接受腹膜透析治疗患者最常见的并发症,是腹膜透析治疗失败的主要原因[1]。采集尿液、腹膜透析流出液标本进行病原体培养是临床诊断UTI、PDAP的金标准,但具有耗时长、检出率低等缺点,且患者使用抗生素时可影响培养结果。因此,探讨快速、准确识别病原体的方法,是临床诊断和治疗感染性疾病的关键[2,3]。高通量测序技术是一种新型病原体测序方法,不依赖于传统的培养法,可同时测定几百万条甚至上亿条DNA或RNA序列,具有通量高、无偏倚性、测序速度快等特点,理论上可检测所有已知的病原体[4],目前已应用于血液、神经系统及呼吸系统感染等疾病的诊断,且诊断灵敏度较高[5,6,7]。本研究探讨高通量测序技术在UTI、PDAP患者病原学诊断中的应用价值,报道如下。

1、资料与方法

1.1一般资料

2019年8月—2020年9月武汉大学人民医院诊治UTI患者77例,男19例,女58例;年龄14～92(61.6±15.6)岁。同期诊治PDAP患者36例,男20例,女16例;年龄27～81(49.9±13.8)岁。入选标准:(1)UTI诊断依据文献[8];(2)行腹膜透析治疗的患者具备以下3项中2项以上者可诊断为PDAP[9]:临床表现为腹痛、腹膜透出液浑浊、伴或不伴发热;腹膜透析流出液白细胞计数>10×109/L,中性粒细胞比率>50%;腹膜透析流出液病原体培养阳性。排除标准:(1)行腹膜透析联合血液透析治疗者;(2)恶性肿瘤患者;(3)其他类型的腹腔或盆腔感染者;(4)有自身免疫性疾病者;(5)腹膜透析治疗时间<1个月者;(6)临床资料不完整者。

1.2方法

1.2.1标本采集

UTI患者收集清晨中段尿标本,PDAP患者收集留腹2h以上的腹膜透析流出液标本,均分为2份,6h内送检。

1.2.2培养法分离及检测病原体

中段尿、腹膜透析流出液标本各取1份,应用美国BD公司Phoenix-100型全自动微生物分析仪,根据《全国临床检验操作规程(第4版)》[10]中细菌和真菌检验流程完成病原体的培养、分离、菌种鉴定操作。质控菌株:大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、白色假丝酵母菌ATCC10231、肺炎链球菌ATCC49619购自美国BD公司。

1.2.3高通量测序法检测病原体

取另1份中段尿、腹膜透析流出液标本,采用高通量测序法检测病原体:(1)DNA提取:取标本0.5～3mL,经玻璃珠混合震荡后按照SansureDNAExtractionKit试剂盒(中国圣湘生物公司)说明书步骤提取DNA。(2)文库构建与测序:构建文库平均每个样本投入DNA约50ng,建库试剂盒为SQK-LSK109(英国OxfordNanoporeTechnologies公司),Nanopore测序不需要进行片段化,加接头使用的酶为NEBNextQuickT4DNALigase,根据试剂盒说明书进行操作。PCR扩增后16S靶向扩增的目标条带约为1.5kb,ITS的目标条带约为400～800bp,NTS测序建库过程中无需电泳,文库定量使用Qubit3.0。质控分析后使用NanoporeMinION(英国OxfordNanoporeTechnologies公司)进行高通量测序。(3)数据分析:测序数据按照测序标签拆分样本,剪掉接头,过滤低质量及重复序列,去除宿主序列,去宿主过程中使用的人源宿主的参考基因组为从美国国立生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)病原数据库下载的GRCH38),病原体比对的数据库为从NCBI下载的16S和ITSgene数据库,其中包括19088株细菌、8082株真菌和231株非典型病原体(支原体、衣原体、脲原体、螺旋体等)参考基因。与数据库进行比对,并将比对后的数据按照病毒、细菌、真菌和支原体等进行分类和排列。

2、结果

2.1UTI患者2种方法检测结果

高通量测序法检出病原体70例(90.9%);培养法检出病原体27例(35.1%),1例检测结果与高通量测序结果完全一致,20例检测结果与高通量测序结果部分一致(高通量测序法检测出培养法未检测到的潜在病原体),5例与高通量测序结果相矛盾,1例高通量测序未检出病原体。以培养法为金标准,高通量测序法检出UTI患者病原体的灵敏度为96.3%。见表1。

表1UTI患者2种方法检测结果

2.2PDAP患者2种方法检测结果

高通量测序法检出病原体28例(77.8%);培养法检出病原体11例(30.6%),7例检测结果与高通量测序结果完全一致,1例与高通量测序结果部分一致(高通量测序检出培养法未检测到的潜在病原体),3例高通量测序未检出病原体。以培养法为金标准,高通量测序法检查PDAP患者病原体的灵敏度为72.7%。见表2。

表2PAPD患者2种方法检测结果

2.3高通量测序法检测病原体结果

2.3.1UTI患者检出病原体情况

70例阳性UTI患者尿标本中分离出病原体169株,其中细菌136株,真菌25株,脲原体6株,支原体2株。见表3。

表3UTI患者检出病原体情况

2.3.2PDAP患者检出病原体情况

28例阳性PAPD患者检出病原体39株,其中细菌28株,真菌9株,结核分枝杆菌1株。见表4。

表4PAPD患者检出病原体情况

2.4培养法检出病原体结果

2.4.1UTI患者检出病原体情况

27例阳性UTI患者尿标本共分离出病原体27株,其中大肠埃希菌11株,屎肠球菌2株,肺炎克雷伯菌2株,产超广谱β-内酰胺酶菌2株,无乳链球菌1株,铜绿假单胞菌1株,摩根摩根菌1株,粪肠球菌1株,鹑鸡球肠菌1株,鲍曼不动杆菌1株,近平滑念珠菌2株,白色假丝酵母菌1株,克柔念珠菌1株。

2.4.2PDAP患者检出病原体情况

11例阳性PDAP患者腹膜透析流出液标本共分离出病原体11株,其中大肠埃希菌3株,金黄色葡萄球菌2株,屎肠球菌1株,粪肠球菌1株,铜绿假单胞菌1株,皮炎外瓶霉1株,近平滑念珠菌1株,曲霉菌1株。

3、讨论

传统培养法分离、检测病原体阳性率低,耗时长,难以满足临床诊治UTI、PDAP的需求。高通量测序技术弥补了培养法的不足,可为制定治疗方案提供参考[11,12,13]。本研究结果显示,UTI患者采用高通量测序法检出病原体70例,采用培养法检出病原体27例;PDAP患者采用高通量测序法检出病原体28例,采用培养法检出病原体11例;对培养与高通量测序结果部分一致的UTI、PDAP患者,高通量测序检出培养法未检测到的潜在病原体,提示对UTI、PDAP患者,高通量测序法可在培养阴性的标本中检出潜在的感染病原体;1例培养阳性的UTI患者、3例培养阳性的PDAP患者采用高通量测序法未检出病原体,提示采用高通量测序法检测标本中病原体仍存在错检、漏检可能,尚不能替代培养法成为诊断感染性疾病的金标准。有文献[14]报道,培养法检测病原体的结果受抗生素使用情况的影响,而高通量测序法检测结果受抗生素使用情况的影响小,有利于复杂感染性疾病的诊断。高通量测序法可检出罕见、培养法难以检测出的病原体,在共感染的病原体检出方面表现良好,并且可对抗生素耐药基因进行测序,在抗生素耐药预测中具有明显优势[15]。本研究结果显示,高通量测序阳性70例UTI患者尿标本中分离出病原体169株,以革兰阴性菌为主,与文献[16]报道相符;28例高通量测序阳性PAPD患者腹膜透析流出液检出病原体39株,其中革兰阳性菌、革兰阴性菌均占36.8%,真菌占23.7%,与文献[17]报道大致相同;而培养阳性27例UTI患者尿标本共分离出病原体27株,11例培养阳性PDAP患者腹膜透析流出液标本共分离出病原体11株,检出的病原体尤其是真菌数量明显少于高通量测序法,且未检出支原体、脲原体、结核分枝杆菌等非典型病原体,说明高通量测序法在UTI、PDAP患者标本病原体的检出中较培养法具有优势。

本研究结果提示,对UTI、PDAP患者,采用高通量测序法检测尿液、腹膜透析流出液标本中病原体,在检出的病原体种类上较培养法具有明显优势。但高通量测序结果判读缺乏统一标准[18],检测费用高昂,尚不能替代培养法,在感染性疾病诊断中可作为培养法的有效补充。本研究不足之处:纳入的样本量较少,标本取材过程或实验室微生物可能会污染标本影响检测结果,未应用高通量检测技术检测抗生素耐药基因。因此,高通量测序技术在UTI、PDAP诊治中的作用需进一步研究。

参考文献：

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基金:国家自然科学基金(81370800);湖北省技术创新专项重大项目(2019ACA137)