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达格列净对肾足细胞系MPC5自噬及mTOR/S6K1通路的影响

2025-07-10 62 上传者：管理员

摘要：目的探讨达格列净对肾足细胞系MPC5自噬及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/核糖体蛋白S6激酶1(mTOR/S6K1)信号通路的影响。方法将MPC5细胞分为对照组、高糖组(30 mmol/L葡萄糖)、达格列净组(10 nmol/L达格列净)及3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(10 nmol/L达格列净+6μmol/L 3-MA)。采用CCK-8法检测细胞活力，透射电镜观察细胞超微结构，免疫荧光检测LC3表达，Western blotting检测Synaptopodin、Beclin1及mTOR/S6K1通路蛋白表达水平。结果与对照组比较，高糖组细胞存活率降低，自噬相关蛋白表达上调(P<0.05);与高糖组相比，达格列净组和3-MA组细胞存活率升高，mTOR/S6K1通路蛋白表达下调(P<0.05);与达格列净组比较，3-MA组细胞存活率降低，自噬相关蛋白表达下调(P<0.05)。结论达格列净可通过抑制mTOR/S6K1通路激活MPC5细胞自噬，改善高糖诱导的细胞损伤。

关键词：
mTOR
S6K1
肾足细胞MPC5
自噬
达格列净
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糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)是糖尿病最常见的微血管并发症,目前临床治疗仍以控制血糖和血压为主,缺乏特异性治疗手段[1-2]｡肾足细胞作为肾小球滤过屏障的关键组成,其损伤是DN发生发展的重要环节[3]｡研究表明,高糖环境可显著抑制肾足细胞自噬活性,导致受损细胞器累积和细胞凋亡增加[4-5]｡达格列净作为钠-葡萄糖耦联转运体2(sodium-glucoselinkedtransporter2,SGLT2)抑制剂,除降糖作用外,还具有潜在的肾脏保护效应[6]｡研究发现,达格列净可通过调节哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/核糖体蛋白S6激酶1(mammaliantargetofrapamycin/ribosomalproteinS6kinase1,mTOR/S6K1)信号通路影响细胞自噬过程[7]｡然而,达格列净是否通过调控mTOR/S6K1通路影响肾足细胞自噬尚不明确｡本研究旨在探讨达格列净对肾足细胞系MPC5自噬活性的影响及其与mTOR/S6K1信号通路的关系,为阐明其肾脏保护机制提供实验依据｡

1、材料和方法

1.1主要试剂和仪器

RPMI1640培养基(北京泽平科技);重组小鼠γ干扰素(北京百奥莱博);达格列净(dapagliflozin,国药准字J20170040,10mg/片);3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)(深圳海思安);CCK-8试剂盒(北京康瑞纳);绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)-LC3腺病毒(汉恒生物);Synaptopodin免疫组化试剂盒(上海雅吉);Synaptopodin､Beclin1一抗及相应二抗(上海群己);磷酸化(phosphorylation,p)-mTOR､mTOR､p-S6K1､S6K1一抗及二抗(北京索莱宝);透射电子显微镜(TalosF200XS/TEM,赛默飞世尔);倒置相差显微镜(DMi8,徕卡);酶标仪(168-1130,Bio-Rad);激光共聚焦显微镜(EPYCON,Abberior)｡

1.2细胞培养与分组

人肾足细胞系MPC5(上海生命科学研究院)在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养,加入10U/mL重组γ干扰素诱导分化｡分化成熟的细胞随机分为4组:对照组(常规培养)､高糖组(30mmol/L葡萄糖)､达格列净组(30mmol/L葡萄糖+10nmol/L达格列净)和3-MA组(30mmol/L葡萄糖+10nmol/L达格列净+6μmol/L3-MA),每组设4个复孔｡

1.3细胞活力检测

采用CCK-8法检测细胞活力｡各组细胞培养48h后,加入CCK-8试剂孵育2h,测定450nm光密度值,计算细胞存活率[8]｡

1.4超微结构观察

细胞经2.5%戊二醛固定､脱水､包埋后切片,铀铅染色,透射电镜(TalosF200X)观察自噬体形成｡

1.5自噬活性检测

采用GFP-LC3腺病毒感染细胞,激光共聚焦显微镜(AbberiorEPYCON)观察GFP-LC3斑点形成[9]｡

1.6蛋白表达检测

Westernblotting检测自噬相关蛋白(Synaptopodin､Beclin1)和mTOR､S6K1通路蛋白表达｡以βactin为内参,计算相对表达量｡

1.7统计学分析

采用SPSS22.0软件分析数据｡计量资料以x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验｡P<0.05为差异具有统计学意义｡

2、结果

2.1各组MPC5细胞存活率比较

与对照组比较,高糖组细胞存活率降低(P<0.05);与高糖组比较,达格列净组及3-MA组细胞存活率升高(P<0.05);与达格列净组比较,3-MA组细胞存活率降低(P<0.05;图1)｡

图1各组MPC5细胞存活率比较

2.2各组MPC5细胞电子显微镜观察结果比较

对照组肾足细胞结构完整,细胞器清晰可见,形态正常;高糖组内质网结构受损,足细胞出现足突融合现象;达格列净组与3-MA组内质网受损情况有所改善,足突融合现象减少,足细胞内可见自噬体或自噬泡(图2)｡

图2电镜下各组MPC5细胞结构比较

2.3各组MPC5细胞LC3表达比较

对照组､高糖组､达格列净组､3-MA组MPC5细胞LC3绿色荧光强度分别为(224.11±40.23)､(562.19±50.14)､(1626.50±95.38)､(840.67±80.22)｡与对照组比较,高糖组LC3绿色荧光强度增强(P

图3各组MPC5细胞LC3荧光染色图(400×)

2.4各组MPC5细胞自噬蛋白表达情况比较

与对照组比较,高糖组Synaptopodin､Beclin1蛋白相对表达上调(P<0.05);与高糖组比较,达格列净组及3-MA组Synaptopodin､Beclin1蛋白相对表达上调(P<0.05);与达格列净组比较,3-MA组Synaptopodin､Beclin1蛋白相对表达下调(P<0.05;表1及图4)｡

表1各组MPC5细胞自噬蛋白表达情况比较(n=4)

图4各组MPC5细胞LC3II/I､Beclin1免疫印迹图

2.5各组MPC5细胞mTOR/S6K1通路蛋白表达情况

与对照组比较,高糖组p-mTOR/mTOR､pS6K1/S6K1蛋白比值上调(P<0.05);与高糖组比较,达格列净组及3-MA组p-mTOR/mTOR､p-S6K1/S6K1蛋白比值下调(P<0.05);与达格列净组比较,3-MA组p-mTOR/mTOR､p-S6K1/S6K1蛋白比值上调(P<0.05;表2及图5)｡

表2各组MPC5细胞mTOR､S6K1蛋白相对表达情况比较(n=4)

图5各组MPC5细胞mTOR/S6K1通路蛋白免疫印迹图

3、讨论

肾足细胞是肾小球血液滤过屏障的主要组成部分,肾足细胞的损伤在DN的发病过程中起重要作用,因此维持肾足细胞的结构与功能具有重要意义｡自噬是近几年生物学研究的热门,自噬作用是受损细胞的自我保护机制,而过度自噬则会加重外来刺激诱导的损伤,正常生理情况下肾足细胞具有一定的自噬活性,但肾足细胞自噬缺陷的情况下,肾足细胞会逐渐出现突出融合,导致肾小球硬化,表明自噬作用在肾小球功能障碍中发挥重要作用[10-11]｡袁毅等[12]对狼疮肾炎中肾足细胞进行研究,结果显示自噬作用能够对狼疮肾炎中肾足细胞起到保护作用｡目前,达格列净已被证实对于改善DN具有一定效果,但其作用机制是否与自噬有关尚无定论,mTOR/S6K1通路参与细胞生长发育及营养代谢的信息传递,且多数研究均表明,该通路参与细胞自噬作用[13-14]｡因此,本研究旨在探究达格列净对MPC5自噬及mTOR/S6K1通路的影响｡

自噬作用能够提高细胞抵御外来刺激的能力,降低损伤｡蔡根深等[15]研究显示,下调PHLPP1表达,能够激活PI3K/Akt/mTOR通路,从而激活高糖诱导的人足细胞自噬,同时促进足细胞凋亡｡朱巧林等[16]研究表明,达格列净能够抑制高糖诱导的人脐静脉内皮细胞的自噬作用,从而对人脐静脉内皮细胞起到保护作用｡本研究发现,高糖组细胞存活率降低､LC3绿色荧光强度及Synaptopodin､Beclin1蛋白表达量高于对照组,应激状态下细胞会发起自噬作用进行自我修复,而达格列净组细胞存活率升高､LC3表达增多,Synaptopodin､Beclin1蛋白表达上调,提示达格列净能够激活细胞自噬作用,从而降低肾足细胞损伤[17]｡

mTOR/S6K1通路中mTOR是一种感受器,能够接收细胞外的营养物质及能量等信号变化,S6K1是mTOR下游蛋白,参与调控细胞增殖､分化等生理过程[18]｡尹昀东等[19]研究显示,丹蛭降糖胶囊能够通过调控mTOR/S6K1通路改善DN大鼠肾足细胞损伤及肾脏病理学变化｡国外一项研究表明,益气活血方能够通过mTOR/S6K1/LC3通路,调控足细胞自噬作用,降解糖基化终产物[20]｡本研究中高糖组p-mTOR/mTOR､p-S6K1/S6K1蛋白相对表达较对照组上调,表明高糖环境下mTOR/S6K1通路被激活,当外界环境受到高糖刺激时,mTOR磷酸化激活S6K1蛋白,促进S6K1磷酸化,诱导肾足细胞增殖､分化,抑制足细胞自噬活性｡达格列净干预后,p-mTOR/mTOR､p-S6K1/S6K1蛋白相对表达下调,表明达格列净能够抑制mTOR/S6K1通路,从而激活肾足细胞自噬作用,下游靶蛋白Synaptopodin､Beclin1表达上调,在达格列净的基础上加入自噬抑制剂3-MA,上述指标反向调控,表明3-MA能够抵消部分达格列净对肾足细胞的自噬激活作用,进一步说明达格列净对肾足细胞自噬活性具有激活作用｡

综上所述,达格列净能够提高MPC5细胞存活情况,同时激活MPC5细胞自噬作用,其作用机制可能与抑制mTOR/S6K1通路有关｡本研究仅对mTOR/S6K1通路进行研究,未来会加强对mTOR/S6K1通路上下游相关基因以及其他信号通路基因的表达情况进行深入分析,为研究结论提供更充分的证据支持,为保护肾足细胞､治疗DN提供新的研究方向｡

参考文献:

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