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CRISPR/Cas9基础上敲除KNDC1的人脐静脉内皮细胞具有抗衰老能力

2020-09-05 368 上传者：管理员

摘要：目的：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的KNDC1并观察其抗衰老能力。方法：通过在线软件设计靶向于KNDC1外显子1、2、3的5个sgRNAs,并将其构建到CRISPR/Cas9载体中;经测序确认序列正确后,将重组质粒转染HeLa细胞和HUVECs,48h后用real-timePCR和Westernblot分别检测KNDC1mRNA和蛋白表达水平;用SA-β-gal染色检测细胞衰老情况;用2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针检测细胞内活性氧水平。结果：测序结果显示,设计的5个sgRNAs全部插入到了CRISPR/Cas9载体中,序列正确,构建成功。将5个重组质粒转染到HeLa细胞后发现第4和5号载体敲除效率较高,接下来将4和5号重组质粒转染到HUVECs中,发现与转染对照质粒相比,转染了4和5号重组质粒的HUVECsKNDC1mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05),衰老HUVECs数量和细胞内活性氧水平明显减少。结论：利用CRISPR/Cas9技术能有效敲除HUVECs的KNDC1,敲除KNDC1的HUVECs具有抗衰老能力。

关键词：
Cas9系统
CRISPR
KNDC1
基因编辑
脐静脉内皮细胞
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衰老(aging)是慢性疾病发展的主要危险因素,影响包括心血管系统、肌肉和骨骼在内的各种组织[1]。血管衰老是多种心血管病变的基础,如动脉粥样硬化斑块形成、心肌梗死、心力衰竭等[2]。由于动脉粥样硬化性心血管疾病是全世界死亡的主要原因[3],而且内皮细胞衰老是血管疾病的一个关键危险因素[4],因此,迫切需要研究预防内皮细胞衰老的方法。

KNDC1[kinasenon-catalyticC-lobedomain(KIND)containing1]是一种Ras鸟嘌呤核苷酸交换因子(RasGEF),包含两个激酶非催化c-叶结构域(KIND)的串联重复序列,被认为与蛋白质-蛋白质相互作用有关[5]。前期研究发现过表达KNDC1能够促进HUVECs衰老[6]。但是敲除KNDC1是否能够延缓HUVECs衰老尚不明确。CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)/Cas9是细菌和古细菌形成的一种适应性免疫防御,可用来对抗入侵的病毒及外源DNA[7],其利用single向导RNA(single-guideRNA,sgRNA)介导的Cas9蛋白对基因组DNA特异性地切割[8]。因此本研究将利用CRISPR/Cas9技术敲除HUVECs的KNDC1,并观察敲除KNDC1后HUVECs的抗衰老能力。

1、料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系:

人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVECs)为本室从脐静脉中分离,用含10%胎牛血清、100U青霉素、100U链霉素、含表皮生长因子的ECM培养基(ScienCell公司)在37℃、5%CO2孵箱(ThermoFisherScientificals公司)中传代培养。人宫颈癌细胞系HeLa(HeLa细胞)(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)用含10%胎牛血清、100U青霉素、100U链霉素的DMEM培养基,在37℃、5%CO2孵箱中传代培养。

1.1.2 载体和试剂:

Guide-itCRISPR/Cas9Systems质粒构建试剂盒、一步法RT-qPCR试剂盒(TaKaRa公司)。BCA试剂盒、转染试剂jetPRIME、Trizol(ThermoFisherScientificals公司);RIPA裂解液(北京索莱宝有限责任公司);抗KNDC1抗体、2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针(Sigma-Aldrich公司);抗β-actin抗体(SantaCruz公司);山羊抗兔的二抗(北京中杉金桥生物有限公司);衰老相关β-半乳糖苷酶染色试剂盒(SA-β-gal)(碧云天生物技术有限公司)。

1.1.3 引物合成和测序:

所有引物与寡核苷酸的合成及样品测序均由生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA打靶载体的构建:

利用麻省理工大学张峰实验室提供的网络工具(http://crispr.mit.edu)设计KNDC1的sgRNA,在正义链模板的5′端添加CCGG;反义链模板的5′端添加AAAC,以便与线性CRISPR/Cas9质粒载体的黏性末端互补。根据KNDC1蛋白的结构域功能,分别设计了靶向KNDC1-Exon1/2/3的5个sgRNAs(表1),分别命名为KNDC1-sgRNA1、KNDC1-sgRNA2、KNDC1-sgRNA3、KNDC1-sgRNA4和KNDC1-sgRNA5。

sgRNA寡核苷酸单链退火形成双链:将合成的寡核苷酸用DEPC水进行重悬,使其终浓度为100μmol/L。取上游链和下游链各1μL,补加8μL的退火缓冲液组成10μL体系。按以下程序进行退火:95℃2min,85℃降温至30℃,梯度为10min,25℃保持。将退火后的寡核苷酸用退火缓冲液稀释至100nmol/L。连接载体:线性化pGuide-it-ZsGreen1载体质粒2μL(7.5ng/μL),退火后sgRNA寡核苷酸双链或Guide-it对照退火寡核苷酸双链1μL(100nmol/L),补水至2μL,加入5μLDNA连接混合物[取于Guide-itCRISPR/Cas9System(Green)],16℃孵育30min。连接产物转化DH5α感受态细胞,1mLSOC培养液37℃水浴1h;氨苄抗性平板筛选,37℃倒置培养过夜后挑取单克隆,按照质粒小提步骤提取质粒,送北京生工测序验证。

1.2.2 在HeLa细胞中验证打靶载体的敲除效率:

将HeLa细胞接种于60mm细胞培养皿,24h后分别取上述构建好的打靶载体及对照载体用jetPRIME转染试剂转染HeLa细胞,通过荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)观察重组质粒的转染效率。转染48h后提取细胞RNA和总蛋白,试验步骤参照Trizol试剂说明书和哺乳动物细胞裂解试剂说明书。然后通过real-timePCR检测KNDC1的转录水平,通过免疫印迹法检测KNDC1蛋白的表达水平,以此来评估打靶载体的敲除效果。

1.2.3 在HUVECs中进行KNDC1敲除:

将HUVECs接种于60mm细胞培养皿,24h后分别转染经HeLa细胞验证的敲除效果好的KNDC1重组载体和对照重组载体,转染48h后,提取细胞RNA和总蛋白,然后通过real-timePCR检测KNDC1的转录水平,通过免疫印迹法检测KNDC1蛋白的表达水平。

1.2.4 SA-β-gal染色检测细胞衰老:

将HUVECs接种于6孔板,分别用KNDC1重组载体和对照重组载体转染HUVECs,换M199培养液继续培养3d,然后按照SA-β-gal染色试剂盒说明书进行衰老检测。

1.2.5 MTT法检测细胞增殖能力:

分别转染KNDC1重组载体和对照重组载体的HUVECs接种于96孔板,设复孔6个,通过MTT法每日检测细胞增殖情况,连续8d。

1.2.6 细胞内活性氧水平的检测:

转染细胞同1.2.5,然后根据制造商的说明用10μmol/L2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)荧光探针在37℃下染色30min。染色后,用PBS洗涤细胞,然后通过荧光倒置显微镜观察细胞内活性氧含量。

1.3 统计学分析

数据均采用均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,各组数据用SPSS17.0进行单因素方差分析(onewayANOVA),LDS-t多重比较进行各组间两两比较。

2、结果

2.1 用于人KNDC1敲除的打靶载体的构建

合成的5个sgRNAs寡核苷酸序列及对照寡核苷酸序列与线性质粒pGuide-it-ZsGreen1载体连接构建重组质粒,挑选氨苄抗性阳性克隆质粒送北京生工测序,测序结果正确的阳性质粒分别名为Cas9-KNDC1-sgRNA1、Cas9-KNDC1-sgRNA2、Cas9-KNDC1-sgRNA3、Cas9-KNDC1-sgRNA4、Cas9-KNDC1-sgRNA5及Cas9-KNDC1-Con(图1,2)。

2.2 筛选打靶效率高的重组质粒

重组质粒成功转入HeLa细胞,转染效率达85%(图3A),重组质粒1、2、3、4和5转染的HeLa细胞KNDC1mRNA水平较对照组显著降低(图3B)(P<0.05);靶基因KNDC1在191和54ku处蛋白表达水平也较对照组均有显著降低(图3C);其中重组质粒Cas9-KNDC1-sgRNA4和Cas9-KNDC1-sgRNA5打靶效率更高(P<0.01),所以后续实验选用重组质粒4和5进行研究。

图1质粒构建示意图

图2阳性克隆测序结果

图3KNDC1在HeLa细胞中的转录和表达水平

2.3 在HUVECs中对KNDC1进行敲除验证

上述重组质粒转染HUVECs,转染效率约为65%(图4A),重组质粒4和5转染的HUVECsKNDC1mRNA水平较对照组显著降低(图4B)(P<0.05);靶基因KNDC1在191和54ku处蛋白表达水平也较对照组均有显著降低(图4C)。

2.4 敲除KNDC1能够延缓HUVECs衰老、增强细胞增殖能力及降低其活性氧水平

与转染Cas9-KNDC1-Con质粒的HUVECs(衰老细胞百分率为64.0%)相比,转染Cas9-KNDC1-sgRNA4和Cas9-KNDC1-sgRNA5质粒的HUVECs衰老细胞数显著降低,分别为3.8%和4.5%(图5A),细胞增殖能力有明显增强(图5B)。与转染Cas9-KNDC1-Con质粒的HUVECs(活性氧染色阳性细胞百分率49.4%)相比,转染Cas9-KNDC1-sgRNA4和Cas9-KNDC1-sgRNA5质粒的HUVECs衰老活性氧水平也有显著降低,分别为3.8%和3.5%(图6)。

3、结论

心血管系统的正常功能对于维持组织稳态和提高机体的最大寿命至关重要。血管内皮细胞衰老是动脉粥样硬化及其他年龄相关心血管疾病的基础[9,10]。KNDC1是2006年发现的基因,日本学者研究发现,其能负调控神经元树突的生长,这一功能与Ras鸟苷酸交换因子活性和蛋白丝/苏氨酸激酶活性相关[11,12]。前期研究发现,过表达KNDC1会使HUVECs衰老细胞数增加[6],KNDC1siRNA处理内皮细胞后,细胞增殖能力增强[13]。但是在HUVECs中敲除KNDC1后,其抗衰老能力是否增强尚未见报道。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了5种人KNDC1敲除重组质粒。该技术是近年来新兴的,高效的基因编辑技术;是由sgRNA介导的Cas9核酸酶对靶基因进行编辑;其不会将外源基因整合到细胞基因组上,生物安全性较高[14,15]。经测序验证重组质粒序列正确后,分别将5种质粒转染到HeLa细胞,通过荧光显微镜观察发现转染效率高达85%。本研究首先选择HeLa细胞验证重组质粒的转染效率,是因为质粒容易转染进入HeLa细胞。接下来通过real-timePCR和Westernblot进行检测,发现5种质粒均能显著降低KNDC1转录和表达水平(P<0.05),其中重组质粒4和5敲除效率较高。因此本实验将在HUVECs中对质粒4和5进行研究。

图4KNDC1在HUVECs中的转录和表达水平

图5在HUVECs中敲除KNDC1后细胞衰老的β-gal染色及细胞增殖

将重组质粒4和5转染HUVECs后,通过荧光显微镜观察发现转染效率为65%,低于HeLa细胞中的转染效率,可能是由于质粒较难进入内皮细胞所致;通过real-timePCR和Westernblot检测发现KNDC1转录和表达水平显著降低,但并未完全敲除,可能是由于小部分HUVECs没有重组质粒进入所致。后续研究将考虑构建KNDC1敲除腺病毒载体来增加敲除效率。此外通过SA-β-gal染色和MTT法实验证实,KNDC1敲除后内皮细胞衰老数显著减少、细胞增殖能力增强,DCFH-DA荧光探针染色结果显示,ROS水平显著降低。在后续实验中,将进一步研究KNDC1影响细胞衰老的信号通路,对其作用机制做进一步的探讨。

图6在HUVECs中敲除KNDC1后细胞活性氧水平的DCFH-DA荧光检测

综上所述,本研究采用了CRISPR/Cas9技术成功构建出重组人KNDC1-Cas9敲除载体。构建的人KNDC1-Cas9敲除载体可用于HUVECs中KNDC1的敲除,将为研究KNDC1在细胞衰老方面的作用提供可靠的技术支持。

参考文献：

[2]张真,廖清池,柳书可,等.微小RNA与血管内皮细胞的衰老关系研究进展[J].中华老年心脑血管病杂志,2018,20:1327-1329.

孙靖玉,姚赫,胡刚,魏洁,郭君,张鑫,林雅军.CRISPR/Cas9介导下敲除KNDC1的人脐静脉内皮细胞具有抗衰老能力[J].基础医学与临床,2020,40(09):1175-1181.

基金:国家自然科学基金(81671391);中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2018-I2M-1-002).