缺血性脑卒中病理变化及时程变化十分复杂，因此应选择建立一个稳定、有效、安全的卒中模型作为长期实验的基础。经过多年的探索，目前已有许多成熟的缺血性卒中模型，包括线栓模型、电凝模型、光化学栓塞模型等[1]。一个良好的卒中模型应包含如下几个条件：可以较好模拟缺血性脑卒中的病理变化；卒中区域稳定可控；成功率高，对动物的损伤小[2]。大脑中动脉闭塞模型(MCAo)阻塞来自栓塞侧的大脑前动脉的血供，以及堵塞接受后交通动脉血供的颈内动脉颅内段，该模型可以较好地重现脑卒中的再灌注损伤，但该模型不易控制卒中体积，易造成大面积脑区梗死，卒中腔的范围浮动大、稳定性较低、动物死亡率高[3]；电凝大脑中动脉末端(dMCAo)的模型在近年反复被使用[4]，此模型不会发生再灌注损伤，但在造模过程中必须打开硬脑膜，脑组织不仅容易受到钻头的损伤，也容易因电凝血管受到热损伤。

光化学栓塞是由静脉注射玫瑰红后再用特定波长的激光照射相应的脑区，光照可以激活玫瑰红染料，形成单线态氧和超氧化物，黏附血小板形成血栓，从而导致大脑皮质缺血损伤[5]。该模型有3个主要的优点：可以通过立体定位仪具有针对性地损伤特定的脑区；病变具有较高的重复性及较低的变异性[6,7]；不同于前两种模型的高死亡率，光化学栓塞对动物损伤较小，动物死亡率较低。但该模型的缺点是易自发恢复[8]。给药方式、剂量、光源参数都可以对光化学栓塞模型产生影响，想要确定是否形成一个稳定良好的卒中腔需要后期进行准确的评估。

此次研究旨在对光化学栓塞模型进行一定的改良：(1)不同于以往研究，采用小型激光器，波长恒定，激光器功率低(<5mW)，对脑组织热损伤小；(2)采用胰岛素针进行股静脉注射，操作简便、稳定；(3)探究了玫瑰红的剂量选择，经不同浓度造模后，选择出最适合的组合。术后不同时间点进行大鼠行为学及组织病理学检测，观察光化学栓塞后的炎症反应、星形胶质细胞和血管的变化，为缺血性卒中相关研究提供理论基础。

1、材料和方法

1.1 设计

完全随机设计，模型组与假手术组对照，多组间差异性单因素方差分析，组间差异性LSD事后多重比较。

1.2 时间及地点

实验于2019年9月至2020年10月在首都医科大学基础科研楼完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物

成年SPF级雄性Wistar大鼠52只，两三月龄，体质量220-250g，由首都医科大学实验动物部订购使用(伦理号：AEEI-2019-140)，许可证号：SCXK(京)2015-0009。

1.3.2 实验使用的试剂及仪器

青霉素(华北制药股份有限公司)；多聚甲醛、蔗糖、戊巴比妥钠、正常封闭用山羊血清(中杉金桥生物公司)；玫瑰红(rosebengal,Sigma公司)；兔抗Iba-1单克隆抗体、鸡抗胶质纤维酸性蛋白、鸡抗NeuN单克隆抗体(均Abcam公司)；AlexaFluor488标记山羊抗鸡荧光二抗、AlexaFluor488标记山羊抗小鼠荧光二抗、AlexaFluor594标记山羊抗兔荧光二抗(均MolecularProbes公司)；3,5-氯化三苯四氮锉(TTC)、Hoechst33258(均Sigma公司)；GL124天平(Sartorius公司)；GPD105-M-12(台湾铨舟光电有限公司)；振动切片机、M-690手术显微镜、CM1850恒冷箱切片机、SP8激光共聚焦扫描(均Leica公司)；灌流泵(LongerPump公司)；BX51正置荧光显微镜(Olympus公司)；立体定位仪(RWD)。

1.4 实验方法

1.4.1 光化学栓塞法制备缺血性卒中模型

首先腹腔注射0.3%戊巴比妥钠(20mg/kg)将大鼠麻醉，仰卧位下用碘伏消毒皮肤，沿鼠的大腿内侧划开，小心分离皮下组织，暴露股静脉。将大鼠固定在立体定位仪中，用碘伏消毒头顶部的皮肤后纵向切割皮肤后暴露颅骨，剥离颅骨表面结缔组织膜，以bregma点(0,0,0)为基础原点，于前囟前2mm，向左旁开3mm为中心，以牙科钻制作一个2mm×2mm的骨窗，不损伤硬脑膜，滴加生理盐水直至脑表面血管清晰位置，之后将532nm固定波长激光器定点照射骨窗处，控制激光照射直径为2mm，距离1cm，此时将大鼠从腿部翻转，利用胰岛素针(0.4mm)将玫瑰红沿股静脉注射0.5mL，之后用无菌棉球压迫止血，照射计时10min，之后缝合大鼠腿部及头部肌肉，皮肤表面进行碘伏消毒。假手术组大鼠不进行激光器定点照射也不注射玫瑰红染料。

1.4.2 动物分组

实验动物共52只，随机分为：假手术组6只；光化学栓塞组46只，其中18只用于筛选造模最佳的玫瑰红浓度(分别于大鼠股静脉注射20,40及80mg/kg玫瑰红，每个浓度6只，注射后1d和7d各取9只)，剩余28只分别为造模后1,3,7,14d取材各6只及行为学实验4只。

1.4.3 组织取材

假手术组大鼠及用于筛选造模最佳玫瑰红浓度的大鼠于术后1d和7d，以及光化学栓塞后1,3,7,14d大鼠分别按时间点取材。大鼠注射戊巴比妥钠进行麻醉后作胸腹正中切口，左心室先注入生理盐水100mL，再经多聚甲醛灌流500mL后，取脑组织放于40g/L多聚甲醛中固定过夜，之后放入30%PB蔗糖中进行脱水至组织沉底。

1.4.4 免疫组织化学染色观察小胶质细胞面积、星形胶质细胞瘢痕厚度和血管密度

于光化学栓塞后1,3,7,14d分别取脑组织。将脱水脑组织-20℃冷冻1h，用OCT包埋后冷冻30min，将脑组织进行30μm厚度的冠状切片，进行免疫组织化学染色，用0.01mol/L的PBS洗涤5min×3,0.01mol/L的PBST溶液洗涤10min×3，将其用体积分数10%正常山羊血清在室温孵育60min，添加一抗在4℃中放置60h，然后将片子拿出，洗涤后添加二抗进行室温孵育7h，使用Hoechst标记细胞核10min。使用的一抗包括：鸡抗NeuN单克隆抗体(1∶500)，鸡抗GFAP多克隆抗体(1∶1000)，兔抗Iba-1单克隆抗体(1∶500)。使用的二抗包括：AlexaFluor488标记山羊抗鸡荧光二抗，AlexaFluor488标记山羊抗小鼠荧光二抗，AlexaFluor594标记山羊抗兔荧光二抗，均1∶200浓度。

1.4.5 图像获取和处理

切片用PB甘油封固后利用BX51正置荧光显微镜，TCSSP8激光共聚焦显微镜扫描成像。利用Imaris软件进行图像处理。利用ImageJ进行区域荧光强度统计及长度测量。小胶质细胞面积：将卒中腔400μm内面积定为总面积，将其内含有小胶质细胞标志物Iba-1阳性细胞面积定位小胶质细胞面积；星形胶质细胞瘢痕厚度：瘢痕壁厚度为卒中腔附近重叠的胶质纤维酸性蛋白阳性区域面积除以此区域的长度；血管密度：通过定量统计单位面积glut-1的荧光占比。

1.4.6 TTC染色

将用于筛选造模最佳玫瑰红浓度的大鼠及假手术组大鼠于术后1d取脑组织，放置于冰水混合的PBS10min，之后将脑组织固定于琼脂并利用振动切片机进行厚度为1mm的冠状切片，取活性脑组织避光放置于37℃，2%的TTC溶液中20min，之后利用4℃的多聚甲醛溶液固定20min。

1.4.7 行为学测试

4只大鼠分别于造模后3,7,28d3个时间点进行行为学测试，以评估大鼠前肢的感觉运动缺失情况。

(1) 圆柱体实验：将大鼠放置在柱形玻璃缸中，观察大鼠20次前肢碰壁的次数，分为左前肢、右前肢、双侧肢体同时触碰3种方式进行统计，将右前肢占比进行统计，用于检测前肢控制的状态。

(2) 网格足部错误实验：格间距2.3cm×2.3cm，将大鼠置于网格上方，观察大鼠行走20步内其前爪落入网眼的次数，与正常步数进行占比统计，用于检测后肢感觉运动缺失情况。

1.5 主要观察指标

(1)动物死亡率与造模成功率；(2)大鼠脑梗死范围及区域；(3)光化学栓塞后炎症反应及星形胶质细胞反应；(4)光化学栓塞后卒中区域血管的反应；(5)光化学栓塞后对行为学的影响。

1.6 统计学分析

实验数据用表示，采用SPSS16.0统计软件进行统计学处理，采用shapiro-wilk检测数据正态分布情况，levene检测方差齐性，利用单因素方差分析比较多组的差异性，LSD事后多重比较分析组间差异性。P<0.05被认为差异有显著性意义。

2、结果

2.1 动物死亡率与造模成功率

实验选用大鼠52只，分为2组，其中46只大鼠制备了光化学栓塞模型，术中死亡2只，其余大鼠在术后恢复良好，存活的44只大鼠均形成了皮质梗死腔，手术模型成功率达到95%;2组共50只大鼠进入结果分析。

2.2 不同浓度梗死范围和区域

为了探索玫瑰红的最优浓度并防止术后的自发恢复，选择了3种浓度进行造模，分别是20,40及80mg/kg。在光化学栓塞手术后1d将3组注射不同浓度玫瑰红的大鼠进行TTC染色，见图1，以观察卒中的梗死范围，并对TTC染色后的梗死面积以前囟的距离为分层进行统计[9]，梗死面积随着浓度加大而不断加大，在照射轴线最为明显，即前囟前2mm[20mg/kg组梗死面积为(4.26±0.58)mm²，40mg/kg组梗死面积为(6.41±0.47)mm²，均小于80mg/kg组梗死面积(16.1±0.65)mm²，均P<0.05]。为了检测长时间点的组织坏死，在7d时间点对损伤的中心区域进行尼氏染色，见图2，发现给药浓度80mg/kg的坏死大于20mg/kg及40mg/kg组。为了避免光化学栓塞自发恢复，进而难以追踪到明确的长期病理变化，最终选择80mg/kg的浓度进行造模。

为了探究不同时间点的梗死腔变化，选择NeuN标记神经元，对光化学栓塞后1,3,7,14d不同时间点的卒中腔中心脑组织进行染色，并统计梗死腔面积占同侧皮质百分比，见图3，随着时间的进展，在1d时神经元数量减少，开始萎缩，梗死面积占同侧皮质百分比为(30.0±1.7)%;3d时神经元明显减少，神经元坏死增多，卒中腔开始形成，梗死面积占比为(27.3±0.44)%;7d时卒中腔内几乎没有神经元存活，并形成局部空腔，梗死面积占比为(21.7±0.3)%，与第3天比较，P<0.05;14d时光化学栓塞形成了神经元坏死、空洞形成的明显卒中腔，面积趋于稳定(20.6±1.1)%，与第7天比较，P>0.05。

2.3 光化学栓塞后炎症反应及星形胶质细胞反应

为了探究光化学栓塞形成缺血性卒中后的炎症反应及星形胶质细胞反应，利用免疫荧光染色的方式，Iba-1标记小胶质细胞及巨噬细胞。在损伤1d时，小胶质细胞胞体形态较小，并且未明显聚集于卒中腔周围，炎症反应不明显；3d时观察到小胶质细胞开始聚集于卒中腔周围；7d开始小胶质细胞呈现明显活化状态，细胞胞体明显肿胀，突起变短增厚，卒中腔周围iba-1阳性细胞面积占比为(34.8±9)%,14d时有更大密度的小胶质细胞聚集于卒中腔周围，炎症反应进一步加重，阳性区域达到(45.7±7.5)%，见图4,iba-1阳性细胞面积占比：第7天与第3天比较及第7天与第14天比较，均P<0.05)。星形胶质细胞形成的瘢痕壁与炎症的进展具有一定相关性，并且会影响卒中腔的范围[10]，利用胶质纤维酸性蛋白标记星形胶质细胞，3d时在卒中腔周围观察到了明显由反应性星形胶质细胞形成的瘢痕壁，并且在7d时进一步增厚，在7-14d时，虽然瘢痕壁厚度未明显增加，但反应性星形胶质细胞突起大量的重叠，形成致密瘢痕壁包围卒中腔[瘢痕厚度：第7天(444±18)μm，第14天(466±13)μm,P=0.1]，见图5。

2.4 光化学栓塞后血管的变化

脑卒中会影响卒中腔及周围的血流供应，剧烈的炎症反应及瘢痕形成亦会使血管崩解，通过葡萄糖转运蛋白(Glut-1)标记血管内皮细胞，观察卒中后的血管变化，见图6。随着卒中腔的形成，第3天时血管密度逐渐下降，血管逐渐变粗，崩解，单位血管面积为(9.25±0.72)%；到第7天血管密度进一步下降(6.18±0.26)%，形成空洞，与第3天比较，P<0.05；在第14天趋于稳定(4.45±0.38)%，与第7天比较，P>0.05。血供逐渐稳定亦是机体自我代偿的方式。

2.5 光化学栓塞后行为学的变化

在圆柱体实验中，光化学栓塞后大鼠右侧(患侧)前肢触壁次数明显减少，并在1个月时间点仍有影响，见图7，大鼠前肢触壁次数：卒中后3d(14.9±1.6)%较卒中前(33.1±0.09)%显著减少(P<0.05)，卒中后1个月(23.7±2.9)%明显增加(P<0.05)。在网格实验中，大鼠的患侧后肢亦会掉落于网格之下，大鼠的错误步数相较于正常组明显增加，见图7，卒中后3d(17.8±2.1)%较卒中前0%显著增加(P<0.05)，卒中后1个月(8.86±1.69)%显著减少(P<0.05)。1个月后大鼠前肢碰壁次数和足部错误次数较之前有所恢复，但碰壁实验和网格错误实验在1个月的时间点相比与1d差异均有显著性意义(P<0.05)，说明光化学栓塞虽然会保留完整的卒中腔，但亦会存在行为学的自发恢复。

3、讨论

建立稳定良好的啮齿类缺血性卒中模型是探索缺血性脑卒中复杂病理变化及后续修复研究的前提。目前国际上主要使用的模型有大脑中动脉闭塞模型(MCAo)、远端中动脉闭塞模型(dMCAo)、内皮素模型等。光化学栓塞的概念最初由ROSENBLUM和EL-SABBAN[11]于1977年提出，并被WATSON等[12]在大鼠脑中的应用而闻名。血栓形成方法的目的是通过事先激活进入血液系统的光敏染料玫瑰红诱发皮质梗塞，从而导致暴露于光源的区域发生局部血管血栓形成。当玫瑰红被光源以适当的波长照射时，它将能量释放给氧分子，进而产生大量的高反应性单线态氧化产物并诱导内皮细胞膜过氧化，导致血小板在光照下不断的聚合，并最终形成血栓[13,14]。

光化学栓塞的优点可以分为如下几个方面：(1)操作简便、耗时短，每只模型大约用时30min，并且不会因操作损伤大脑皮质；(2)可以精确地诱导任何想要的皮质或皮质下区域的局限性梗死，病变的大小具有很高的可重复性，并且可以通过调节光的强度和持续时间或光敏染料的浓度加以控制[15,16];(3)病变对于动物的损伤小，并且不会大量出血，具有很高的存活率[17,18]，在此次的实验中，模型存活率达到了95%。

光化学栓塞模型存在许多可变因素，如玫瑰红浓度、注射方式、注入和照射之间的时间间隔、光源的强度、照射面积和照射时间，这些均会影响卒中腔的大小及深度。此次实验目的是得到稳定、并不易自发恢复的卒中模型，所以研究进行了一些改良：(1)光源的选择：现在普遍采用定制激光光纤及冷光源两种，激光光纤功率一般大于100W，在造模期间存在热量影响，并且定制光纤价格昂贵，功率较大；冷光源需要添加滤光片，且照射时间长，虽然价格低廉但不能保证每次条件一致，此次研究中的模型采用小型激光器，不仅波长恒定，照射距离、范围恒定、价格低廉，并且激光器功率较低(<5mW)，不易对脑形成热损伤；(2)玫瑰红的给药途径：既往研究玫瑰红的注射方式有腹腔注射、尾静脉注射、股静脉针注及股静脉插管4种；腹腔注射玫瑰红吸收效率低，造模波动大；尾静脉注射模型成功率低，对造模操作要求较高，并且尾静脉注射不可视化，无法保证所有液体注射入静脉，影响模型稳定性；股静脉插管需要分离股静脉，操作难度大，容易大量出血，加重动物感染风险及死亡率；作者选用胰岛素针进行股静脉针刺注射，简单分离肌肉后就可进行，并且针头细小、创伤小、出血少；(3)玫瑰红给药剂量：既往研究玫瑰红的静脉注射浓度通常在13-20mg/kg，光化学栓塞一旦损伤过小，卒中腔易自发恢复，无法追踪较长时间点的病理变化，此次实验选用了3个浓度进行纵向对比，最终选择了80mg/kg的浓度进行注射，卒中腔大小合适良好。

缺血性卒中急性期至亚急性期的病理变化迅速复杂，炎症反应及胶质瘢痕反应对于后期干预具有较大影响，小胶质细胞对激活参与修复组织损伤的炎症级联具有显著作用[19,20,21]。在此次研究中，卒中后1d小胶质细胞聚集不明显，随着时间延长细胞密度递增，7d时小胶质细胞胞体明显肿胀，突起变短增厚，呈现活化状态；14d时在卒中腔边界发现有更大密度的小胶质细胞聚拢，炎症反应进一步加重。星形胶质细胞亦在7d时进一步增多，在7-14d时，虽然瘢痕壁厚度未明显增加，但反应性星形胶质细胞突起大量的重叠，形成致密瘢痕壁，包围卒中腔。此前有相关文献研究显示，星形胶质细胞产生促炎因子和趋化因子，它们随后招募小胶质细胞/巨噬细胞清除死亡细胞[22,23]。但过度的炎症反应也可能产生不良后果，更易诱导氧自由基对神经元产生损害[24]。此外，过多的星形细胞相关瘢痕会阻止激活的内源性神经干细胞迁移到卒中区，这一证据进一步支持了此次实验结果，在卒中诱导后的14d内，卒中腔内已不再残存神经元。了解缺血性卒中后炎症变化及星形胶质细胞变化，对选取卒中的治疗方式及干预手段具有一定的指导意义。

此次研究同时追踪了不同时间点缺血性卒中的血流供应和行为学变化。既往相关研究表明，缺血性卒中后的血流供应的变化与行为学变化具有明显相关性[25,26]。缺血性卒中后脑因为自身存在可塑性，会通过血管稳定、血管再生、神经网络重新连接等方面进行自我修复[27,28]，这是脑可塑性恢复下的代偿过程，存在自限性[29]，所以往往无法恢复至原有水平。此次研究发现1d时，卒中腔的血管密度开始减少；3d时血管开始变粗崩解，密度降低；到7d血管崩坏，血管密度继续降低，逐渐形成空洞；但是7-14d趋于稳定。行为学方面，可以看到在光化学栓塞后立即出现感觉及运动功能的缺失，但是随时间推移，又出现小范围的自发恢复，这些自发恢复有可能与血管坏死的逐渐平稳是有关的。

此次研究检测了改良的光化学栓塞模型梗死区域的面积、星形胶质细胞、神经元、小胶质细胞和血管的病理变化，以及造模后对行为学的影响。模型稳定良好，非常适合进行缺血性脑卒中病理变化的研究及相应溶栓药物的研究。激活内源性神经发生，诱导潜在的神经干细胞分化为神经元从而治疗脑损伤成为近些年的热点[30,31]，后期将继续探索卒中后内源性神经干细胞变化，并且为临床治疗缺血性脑卒中提供新的思路及方向。

文章来源：李舒伦,郝鹏,郝飞,段红梅,赵文,高钰丹,杨朝阳,李晓光.改良光化学栓塞法诱导缺血性脑卒中模型大鼠的病理变化[J].中国组织工程研究,2022,26(02):218-224.