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电针对脑缺血再灌注损伤大鼠及神经细胞自噬的影响

2024-05-28 26 上传者：管理员

摘要：目的观察电针“百会”“水沟”穴对脑缺血再灌注损伤大鼠及神经细胞自噬的影响。方法 SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、干预组各16只。假手术组麻醉后只分离左侧颈总、颈内、颈外动脉，不结扎、插线。模型组、干预组采用Zea Longa线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。干预组电针“百会”“水沟”,电流强度1 mA,疏波频率3 Hz,密波频率15 Hz, 1次/d, 20 min/次，连续5 d。假手术组和模型组均不予电针处理，其他处理同干预组。制备模型5 d后，用Longa神经功能评分法对各组进行神经功能评分，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法测定脑梗死体积，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测脑脊液白细胞介素(IL)-6、IL-18、肿瘤坏死因子(TNF)-α的水平，实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western印迹分别检测缺血区海马组织自噬相关蛋白磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)mRNA和蛋白表达。结果与假手术组相比，模型组神经功能评分明显升高，脑梗体积明显增加，脑脊液IL-6、IL-18、TNF-α水平明显升高，PI3K、Akt、mTOR mRNA及蛋白表达明显降低(均P<0.05);与模型组相比，干预组神经功能评分明显降低，脑梗体积明显减小，脑脊液IL-6、IL-18、TNF-α水平明显降低，PI3K、Akt、mTOR mRNA及PI3K、Akt蛋白表达明显增高(均P<0.05)。结论电针“百会”“水沟”穴可能通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路，抑制缺血区细胞自噬从而改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能，减少脑梗死体积。

关键词：
水沟
电针
百会
脑缺血再灌注损伤
自噬
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脑卒中具有高发病率、高死亡率、高致残率及高复发率的特点[1]。随着我国医疗水平的不断提高，对脑卒中的救治越来越规范和系统，脑卒中的死亡率在不断下降[2]。但仍然有70%～80%的患者因功能障碍导致生活不能自理[3],给国家、社会、患者带来沉重的负担。脑缺血再灌注损伤(CIRI)是脑缺血一定时间后再恢复血液灌注引起脑细胞功能代谢障碍及结构破坏进一步加重的病理过程[4]。电针被广泛用于脑卒中的康复治疗[5],疗效显著，能有效改善患者的症状。但目前电针改善大脑神经细胞损伤的机制尚不明确。有研究表明[6],自噬与CIRI导致的神经功能缺损有密切关系。当CIRI发生时，机体会启动自噬。本研究探讨电针对CIRI大鼠及神经细胞自噬的影响。

1、材料与方法

1.1实验动物及分组

雄性SD大鼠48只，体质量220～250 g,购于长沙天勤生物技术有限公司，合格证号SCXK(湘)2019-0015。在南华大学实验动物中心饲养，整个实验过程大鼠的各种处理均得到南华大学第一附属医院伦理委员会的批准，并严格遵守相关规定。适应性喂养1 w后，将大鼠随机分为假手术组、模型组、干预组各16只。

1.2主要试剂和设备

磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抗体：ABCAM公司。实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)仪、Trizol试剂、荧光PCR板：TaKaRa公司。脑缺血再灌注动物模型(MCAO)线栓：长沙迈越生物科技有限公司。2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC):上海齐源生物科技有限公司。白细胞介素(IL)-6、IL-18、肿瘤坏死因子(TNF)-α酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒：南京赛泓瑞生物科技有限公司。台式冷冻离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司。电泳仪，转膜仪：南京中科通仪科技有限公司。一次性无菌针灸针(华佗牌，0.25 mm×25 mm):信诺达医疗器械有限公司。华佗牌SDZ-V电针仪：广州市百分百医疗科技有限公司。

1.3模型制备

参考改良Zea Longa法[7],制备左侧MCAO,术前12 h禁食不禁水。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰卧位固定。于大鼠颈部正中切开，钝性分离左侧颈总动脉，颈内、外动脉。依次结扎颈总动脉近端、颈外动脉，在颈动脉分叉口下2 mm放一活结备用，用微小动脉夹夹住远端颈内动脉。在颈总动脉分叉处附近剪开一个小口，将线拴经颈总动脉插入颈内动脉，遇到轻微阻力时停止插入，将活结系紧，固定线栓，缝合伤口，线拴留于皮肤外。脑缺血2 h后，拔出线拴，使血流再灌注。假手术组只钝性分离出左侧颈总动脉，颈内、外动脉，不插线栓。整个实验过程大鼠置在37℃恒温台上。模型组和干预组在造模成功后每天进行电针干预，连续5 d。

参照Longa评分标准[8]对大鼠进行神经功能缺损评估。0分：大鼠神经功能无缺损；1分：大鼠提尾时向对侧(右侧)前肢屈曲，右上肢伸直受限，神经功能轻度损伤；2分：大鼠不能直行，向右侧旋转，神经功能中度损伤；3分：大鼠行走不稳，行走时向对侧(右侧)倾倒，神经功能重度损伤；4分：大鼠无自发活动或意识障碍，无法行走。术后6 h,根据此评分标准，0分及4分的大鼠将被剔除。

1.4电针方法

参考《实验针灸学》定位“百会”“水沟”穴，用一次性无菌针灸针进行针刺，接通电针仪，疏密波，电流强度1 mA,疏波频率3 Hz,密波频率15 Hz, 1次/d, 20 min/次，连续5 d。假手术组均不予电针处理，其他处理同干预组。

1.5神经功能障碍评分

于造模后第5天进行，Zea longa的5级4分法进行评分。

1.6苏木素-伊红(HE)染色

各组取6只，大鼠脑组织置于4%多聚甲醛固定24 h以上，再用石蜡包埋，冠状面切片，厚约5μm。在光学显微镜下，观察脑组织切片病理形态学的改变。

1.7 TTC染色测脑梗死体积

大鼠断头取脑，取出后的脑组织置于-20℃冰箱内15 min。脑切片机冠状面连续均匀切5个脑片，每片间隔约2 mm。将切好的脑片置于2% TTC溶液中，37℃恒温水中染色30 min。Image-Pro Plus6.0计算脑片的梗死体积与全脑体积。脑梗死体积=各脑片梗死区域体积之和/每片脑片全部区域体积之和。

1.8 ELISA法检测脑脊液IL-6、IL-18、TNF-α水平

2～8℃12 000 r/min离心脑脊液15 min,弃液、甩干，加入100μl生物素标记抗体工作液；弃液、甩干、洗板后，再添加100μl过氧化物酶标记亲和素工作液，弃液、甩干、洗板后，再加90μl底物溶液，在37℃避光条件下显色20～40 min。最后加终止液，终止反应。

1.9用RT-qPCR法测定海马组织PI3K、Akt、mTOR mRNA表达

取保存Trizol溶液中的海马组织约0.02 g,提取总RNA,反转录成cDNA,用紫外分光光度计测定其吸光度值和浓度，用SYBR Green试剂盒进行多聚酶链式反应，计算2-ΔΔCt值，引物序列为：PI3K:上游5′-AGCCACAGATCCACTTAACCC-3′,下游5′-CTTGCTGTCCCCACTTTACTGA-3′;Akt:上游5′-GTCACCTCTGAGACCGACACC-3′,下游5′-GCCTCCGTTCACTGTCCAC-3′;mTOR:上游5′-AGA-ACCAATTATACTCGCTCCCT-3′,下游5′-GCAACCTCAAAGCAGTCCCC-3′;β-actin:上游5′-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3′,下游5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′。

1.10 Western印迹检测PI3K、Akt、mTOR蛋白表达

取0.025 g海马组织制备蛋白标本，冰上裂解10 min,配10%分离胶，4.8%浓缩胶，取240μl蛋白上清，沸水煮7 min。开始电泳(电压75 V,120 min),分别切胶Akt(56～62 kD)、磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK,64 kD)、mTOR(250 kD～289 kD)、PI3K(85 kD)、β-actin(42 kD)。转膜约2.5 h,转膜完毕后，用1×PBST将一抗按照一定比例稀释，1×PBST稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗。用电化学发光(ECL)显色曝光，用Quantity One软件进行灰度分析。

1.11统计学分析

采用SPSS26.0软件进行方差分析、Turkey检验。

2、结果

2.1电针对CIRI大鼠神经功能障碍评分的影响

与假手术组相比，模型组神经功能障碍评分均明显升高(P<0.05);与模型组相比，干预组神经功能障碍评分均明显降低(P<0.05)。见表1。

2.2各组海马组织病理学观察

假手术组海马组织结构清晰，脑神经细胞排列整齐，细胞核位于中间，细胞核与细胞质染色较均匀且一致。模型组海马组织出现较明显的梗死区域，可见神经细胞水肿、核固缩边缘化、核仁消失、组织疏松、空泡排列。与模型组相比，干预组海马组织神经细胞细胞核固缩、空泡、水肿等病理改变有明显改善。见图1。

2.3电针对CIRI大鼠脑梗死体积的影响

白色区域表示为脑梗死区域，红色区域表示非脑梗死区域。假手术组未出现脑梗死。与假手术组相比，模型组脑梗死体积均明显增加(P<0.05);与模型组相比，干预组脑梗死体积均明显减小(P<0.05)。见表1、图2。

2.4电针对CIRI大鼠脑脊液IL-6、IL-18、TNF-α水平的影响

与假手术组相比，模型组脑脊液IL-6、IL-18、TNF-α水平均明显升高(P<0.05);与模型组相比，干预组脑脊液IL-6、IL-18、TNF-α水平均明显降低(P<0.05)。见表1。

2.5电针对PI3K、Akt、mTOR mRNA及蛋白表达的影响

与假手术组相比，模型组PI3K、Akt、mTOR mRNA及蛋白表达均明显降低(P<0.05);与模型组相比，干预组PI3K、Akt、mTOR mRNA及PI3K、Akt蛋白表达均明显升高(P<0.05)。见表1、表2、图3。

表1各组神经功能障碍评分、脑梗死体积、脑脊液IL-6、IL-18、TNF-α水平及PI3K、Akt、mTOR mRNA表达比较

图1各组海马组织(HE染色，×200)

图2各组脑梗死体积比较

表2各组PI3K、Akt、mTOR蛋白表达比较

图3各组PI3K、Akt、mTOR蛋白表达比较

3、讨论

缺血性脑卒中是由于脑血管内血栓形成，导致脑组织供血供氧不足而导致脑组织坏死的总称，是导致死亡和残疾的主要原因[9],在治疗上以恢复血供为主[10],但恢复血供会导致CIRI[11],如何减轻CIRI是治疗的关键。

电针作为一项传统、重要的治疗方法，有保护缺血性脑卒中神经功能的作用[12]。CIRI在中医学里属于“中风病”范畴[13],以半身不遂，口眼歪斜为主要症状。我国的中医理论认为，治疗脑部疾病，应按“病变在脑、首取督脉”的取穴原则。“百会”属督脉，是足太阳、手足少阳、足厥阴与督脉交汇之处，具有开窍醒脑、回阳固脱之功效。“水沟”是督脉穴，督脉与手阳明经的交会穴，是“醒脑开窍”的主穴，故本实验选取“水沟”“百会”穴。有研究表明，电针刺激“水沟”“百会”穴，CIRI大鼠血管内皮生长因子表达上调，促进脑血管形成[14],保护脑组织[15],增加大鼠脑梗死区域血流再灌注[16],抑制神经细胞凋亡[17],促进大脑神经功能重塑。本研究结果与徐疏影等[18]研究结果一致。

CIRI的发生与炎症反应密切相关，有效抑制炎性因子的释放是治疗CIRI的重要方法之一[19]。本研究结果表明，电针“水沟”“百会”穴可抑制CIRI导致的炎症反应，从而治疗CIRI。

自噬是指细胞在自噬相关基因的调控下，溶酶体降解胞内变性、受损物质(如脂类，蛋白质等)及细胞器的过程，属于一种高度保守的生理机制[20,21],自噬在真核细胞内广泛存在。自噬有3种类型：巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬[22]。其中，巨自噬(简称自噬)与CIRI的关系最为广泛[23]。在自噬过程中，细胞质中变性的细胞器及大分子物质，被内质网、线粒体来源的单层或双层膜包裹形成自噬体[24,25,26]。然后，自噬体外膜与溶酶体膜相融合，进一步形成自噬溶酶体[27,28],自噬体内的待降解物被一系列的水解酶降解，最终完成整个自噬过程。大量研究表明，自噬参与了CIRI的发生过程[29],因此调节细胞自噬水平是治疗CIRI的重要机制之一。

自噬的调节涉及了多条信号通路，其中最主要的是PI3K/Akt/mTOR信号通路。PI3K被多种因素激活，激活后产生第二信使3,4,5-三磷酸磷脂肌醇PIP3[30]。PIP3与磷酸肌醇依赖激酶(PDK)1及含有PH结构域的Akt结合，进而改变Akt的蛋白结构，导致膜上的PDK1蛋白发生磷酸化，进而活化Akt[31]。Akt被活化后可以直接或间接磷酸化mTOR,mTOR活化后，形成mTOR复合物(TORC)1,mTORC1主要调节蛋白合成与细胞自噬。激活的mTORC1可使一系列自噬启动蛋白磷酸化，进而抑制自噬形成[32,33]。Carloni等[34]对脑缺血SD大鼠注射PI3K抑制剂、自噬抑制剂、mTOR诱导剂后，发现PI3K/Akt/mTOR信号通路参与了脑缺血造成的损伤。也有研究表明[35,36,37,38],mTORC1还可抑制参与自噬相关蛋白合成的转录因子，从而减少自噬发生。因此，检测自噬相关蛋白PI3K、AKT、mTOR表达，可以反映CIRI后自噬活性水平。本研究结果说明，MCAO大鼠自噬激活，电针提高了脑神经细胞PI3K、AKT、mTOR表达，从而抑制细胞自噬。

综上，电针刺激“百会”“水沟”穴可能通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，抑制脑神经细胞自噬，改善CIRI大鼠神经功能缺损程度，减少脑梗死体积从而发挥脑神经护作用。但其具体机制，仍需深入研究，后续将继续研究不同频率电针对CIRI大鼠神经功能及细胞自噬的影响。

参考文献:

[3]张通,赵军.中国脑卒中早期康复治疗指南[J].中华神经科杂志,2017;50(6):405-12.

[6]王晓茹,安芳.自噬及其在脑缺血再灌注损伤中作用机制[J].神经药理学报,2016;6(1):41-8.

[13]张勇.针刺治疗脑缺血再灌注损伤相关信号通路的机制研究进展[J].上海针灸杂志,2021;40(2):234-42.

[14]姜杨阳,穆晓红.针刺对脑缺血大鼠血管生成和细胞外信号调节激酶1/2信号通路的影响[J].中医学报,2017;32(11):2166-70.

[15]曾超,陈静,刘文兵,等.电针对脑缺血再灌注小鼠脑组织NOX2/gp91phox表达的影响[J].中国中医药科技,2021;28(1):9-13.

[16]徐彦龙,徐秀梅,杨正飞,等.电针“水沟”对脑梗死大鼠脑动脉血管平滑肌中可溶性鸟苷酸环化酶及蛋白激酶G表达的影响[J].针刺研究,2020;45(10):789-92,805.

[17]胡嘉恒,樊萍,张丽荣,等.电针通过调控神经珠蛋白及PI3K/AKT信号通路抑制胆红素脑病诱导的SD乳鼠脑颞叶皮质细胞凋亡[J].中国生物化学与分子生物学报,2021;37(6):772-81.

[18]徐疏影,李文倩,洪浩,等.电针对脑缺血再灌注大鼠自噬相关蛋白LC3-Ⅱ､Beclin1表达的影响[J].南京中医药大学学报,2021;37(2):270-4.

基金资助:国家自然科学基金(81973917);湖南省自然科学基金(2021JJ30616,2021JJ30617,2020JJ5512);湖南省临床医疗技术创新引导项目(2020SK51811);湖南省卫生健康委项目(20200474);

文章来源:黄夏荣,封蔚彬,胡莉芝,等.电针对脑缺血再灌注损伤大鼠及神经细胞自噬的影响[J].中国老年学杂志,2024,44(10):2443-2448.