摘要:目的探讨黄芪甲苷Ⅳ通过调控核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶-1(HO-1)信号通路对尿毒症模型大鼠血管内皮的保护作用。方法将大鼠分为假手术组、模型组、黄芪甲苷低(100mg/kg)、高(200mg/kg)剂量组、Nrf2抑制剂组(2mg/kg)、黄芪甲苷高剂量+Nrf2抑制剂(200mg/kg+2mg/kg)组,每组12只。各组腹腔注射干预给药结束后,用酶联免疫吸附法(ELISA)测血清肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)、血β2-微球蛋白(β2-MG)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;透射电镜观察肾组织血管结构病变;免疫荧光法检测活性氧簇(ROS);免疫荧光共定位法测血管内皮标志物CD31与Nrf2在肾组织中表达;免疫组化法检测肾组织HO-1及血管内皮损伤相关标志物-内皮型一氧化氮(eNOS)在肾组织中表达;蛋白免疫印迹法检测血管生成素样蛋白6(ANGPTL6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达。结果与假手术组相比,模型组大鼠肾小管周毛细血管管腔红细胞聚集、内皮细胞肿胀及增大、管腔狭窄及受压严重;Scr、BUN、β2-MG、TNF-α及IL-6等分泌量变化明显(P<0.05);肾组织ROS、肾血管组织HO-1及eNOS阳性表达;CD31与Nrf2阳性共表达、肾组织ANGPTL6及MCP-1蛋白表达水平均升高(P<0.05)。与模型组相比,黄芪甲苷低、高剂量组大鼠肾小管周毛细血管管腔红细胞聚集、内皮细胞肿胀及增大缓解;血清毒素及炎性因子水平、肾组织ROS、肾血管内皮损伤相关蛋白ANGPTL6、MCP-1、eNOS表达降低(P<0.05);肾血管组织HO-1、CD31与Nrf2阳性共表达水平均升高(P<0.05);Nrf2抑制剂组大鼠肾小管周毛细血管管腔红细胞聚集、内皮细胞肿胀、增大进一步加重。上述指标变化趋势与黄芪甲苷Ⅳ剂量组相反(P<0.05)。结论黄芪甲苷Ⅳ可能通过促进Nrf2/HO-1通路介导的抗炎、抗氧化途径激活,减轻尿毒症大鼠肾血管内皮损伤。
尿毒症(uremia)是各种晚期的肾脏病共有的临床综合征。在中国,尿毒症发病率和病死率随着老龄化人口的增加而不断上升[1]。目前研究发现,血管内皮功能障碍,是尿毒症的首要死亡原因,也是临床研究的重点和难点问题[2]。核因子E2相关因子2(nuclearfactor-E2-relatedfactor2,Nrf2)/血红素氧合酶-1(hemeoxygenase1,HO-1)在细胞抗氧化损伤和抗炎性损伤过程中发挥主要作用,并参与血管内皮损伤过程[3]。黄芪甲苷Ⅳ(astragalosideⅣ)是中药黄芪的主要活性成分,具有抗炎、降血脂、改善糖尿病引起的血管病变和心肌病等作用[4],但其作用机制尚不清楚,本文通过肾脏切除法建立大鼠尿毒症模型,对此进行探讨。
1、材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物:
SPF级SD雄性大鼠,体质量:220~240g[广东省医学实验动物中心,生产许可证号为SCXK(粤)2016-0002],动物质量合格证号为省科委2000A027。
1.1.2 主要试剂
黄芪甲苷Ⅳ(上海阿拉丁生化科技有限公司);Nrf2抑制剂(MedchemExpress公司);白细胞介素-6(IL-6)酶联免疫(ELISA)试剂盒和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司);肌酐(Scr)ELISA试剂盒(上海一研生物科技有限公司);尿素氮(bloodureanitrogen,BUN)ELISA试剂盒(上海雅吉生物科技有限公司);血β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)ELISA试剂盒(上海研生实业有限公司);兔抗大鼠一抗Nrf2、HO-1(ProteinechGroup公司);小鼠抗CD31、兔抗内皮型一氧化氮(endothelialnitricoxidesynthase,eNOS)、血管生成素样蛋白6(angiopoietinlikeprotein6,ANGPTL6)、单核细胞趋化蛋白-1(monocytechemotacticprotein-1,MCP-1)等抗体(Abcam公司)。
1.2 方法
1.2.1 大鼠的分组及处理:
取70只大鼠,按文献[5]方法切除占肾脏1/3的上极和下极左肾肾脏,术后1周进行完全摘除右肾手术,制备尿毒症模型,4周后大鼠成活,随机取2只大鼠剩余肾脏进行镜检,若出现肾血管内皮出现水肿、增大现象,视为造模成功,共造模成功60只(有3只于术后1周死亡,2只术后3周死亡,3只手术失败死亡),将造模成功的大鼠随机分为模型组、黄芪甲苷低(100mg/kg)、高(200mg/kg)剂量组、Nrf2抑制剂组(2mg/kg)、黄芪甲苷+Nrf2抑制剂组(200mg/kg+2mg/kg),每组12只。另取12只大鼠,仅行麻醉和暴露双肾,不做手术切除,作为假手术组。黄芪甲苷及Nrf2抑制剂参照文献[6,7]设置剂量,用0.9%氯化钠溶液稀释成为10.0、20.0、0.2mg/mL的混悬液,按10mL/kg的剂量腹腔注射给药,黄芪甲苷给药3次/d,Nrf2抑制剂给药1次/d;黄芪甲苷+Nrf2抑制剂组给予黄芪甲苷的同时腹腔注射给予Nrf2抑制剂;假手术组及模型组给予等量0.9%氯化钠溶液,各组均连续给药4周,给药期间观察大鼠行为及死亡状况。
1.2.2 采集标本及透射电镜观察肾血管病变:
末次给药12h后,麻醉大鼠,取腹主动脉血3mL,3000r/min离心10min后,取上清液于-20℃冰箱保存备用。处死大鼠,解剖取剩余肾脏组织,经磷酸缓冲盐冲洗后,切取肾组织0.5g置于-80℃冰箱保存,剩余肾组织分成2部分,一部分送于电镜室进行镜检并观察拍照;另一部分制成冰冻切片备用。
1.2.3 ELISA检测大鼠血清Scr、BUN、β2-MG、TNF-α、IL-6水平:
以ELISA试剂盒说明书方法检测Scr、BUN、β2-MG及血清TNF-α、IL-6水平。
1.2.4 免疫荧光检测肾组织ROS蓄积水平:
取部分新鲜冰冻切片,加入二氢乙啶(dihydroethidium,DHE)探针并于室温下孵育20min后,置于荧光显微镜下观察组织染色情况。并随机取5个视野,用ImageProPlus5.0图像分析系统以单位面积内绿色荧光强度强弱代表细胞中ROS相对水平。
1.2.5 免疫荧光检测CD31与Nrf2在肾组织中表达:
取切片,加入特丁基对苯二酚及0.25%曲拉通(TritonX-100)处理透化后,加入一抗(兔抗鼠Nrf2、小鼠抗大鼠CD31,(1∶200))4℃孵育过夜,加入二抗(TRITC标记的山羊抗兔IgG、FITC标记的山羊抗小鼠IgG,稀释倍数为1∶200)孵育显色后,用防猝灭液封片后于激光共聚焦显微镜下观察,拍照。
1.2.6 免疫组化法检测肾组织HO-1、eNOS阳性表达:
抗原修复后,加入一抗抗体(HO-1、eNOS,1∶500)室温孵育过夜后,加入羊抗兔二抗(1∶1000)室温孵育后,加DAB显色、苏木精复染封片后于光镜下拍照,随机取5个视野,观察肾组织血管染色情况,并采用ImageProPlus5.0图像分析系统分析被染成棕黄色的区域域面积,结果以5个视野阳性表达的平均吸光度值表示。
1.2.7 Westernblot检测大鼠肾组织ANGPTL6、MCP-1蛋白表达水平:
将-80℃冻存的肾组织,4℃解冻后,于冰上用组织匀浆器匀浆,离心分离后,用蛋白提取试剂盒提取蛋白,BCA法检测蛋白浓度后,取50μL进行电泳和转膜反应,并加入一抗(ANGPTL6、MCP-1(1∶1000),β-actin(内参,1∶2000)抗体4℃孵育过夜,加入HRP标记的羊抗兔二抗溶液(1∶2000)室温孵育4h,用化学发光法显色,以化学发光仪观察条带并拍照。
1.3 统计学分析
以SPSS22.0软件对实验数据进行统计分析,计量资料以均数±标准差(x¯±s)表示,组间比较进行单因素方差分析,进一步两组间比较行SNK-q检验。
2、结果
2.1 黄芪甲苷Ⅳ对大鼠一般行为的影响
假手术组大鼠无死亡。模型组、黄芪甲苷+Nrf2抑制剂组有3只死亡,大鼠形体消瘦、生长缓慢,饮食较少。黄芪甲苷低、高剂量组大鼠给药期间无死亡,且体重减轻及饮食减少现象有所改善。Nrf2抑制剂组有5只死亡,且体质量减轻、饮食减少现象进一步加重。
2.2 黄芪甲苷Ⅳ对大鼠血清Scr、BUN、β2-MG水平的影响
与假手术组相比,模型大鼠血清Scr、BUN、β2-MG水平升高(P<0.05)。与模型组相比,黄芪甲苷低、高剂量组大鼠血清Scr、BUN、β2-MG水平回降(P<0.05),且高剂量组优于低剂量组;Nrf2抑制剂组大鼠血清Scr、BUN、β2-MG水平升高(P<0.05)(表1)。
2.3 黄芪甲苷Ⅳ对大鼠肾组织病理损伤的影响
假手术组大鼠肾小管毛细血管周结构正常;与假手术组相比,模型组大鼠肾小管周毛细血管管腔红细胞聚集、内皮细胞肿胀及增大、管腔狭窄及受压明显;与模型组相比,Nrf2抑制剂组肾小管周毛细血管管腔红细胞聚集、内皮细胞肿胀及增大进一步增加;黄芪甲苷低、高剂量组大鼠上述病理损伤减轻明显,且随黄芪甲苷剂量增加上述病理损伤改善越显著;黄芪甲苷+Nrf2抑制剂组上述病理损伤与模型组相近(图1)。
2.4 黄芪甲苷Ⅳ对大鼠肾组织ROS水平的影响
与假手术组相比,模型组大鼠肾组织ROS水平升高(P<0.05)。与模型组相比,黄芪甲苷低、高剂量组大鼠肾组织ROS水平回降(P<0.05),且随剂量升高其回降越明显;Nrf2抑制剂组大鼠肾组织ROS水平升高(P<0.05)(图2,表2)。
2.5 黄芪甲苷Ⅳ对大鼠血清TNF-α、IL-6水平的影响
与假手术组相比,模型组大鼠血清TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)。与模型组相比,黄芪甲苷低、高剂量组大鼠血清TNF-α、IL-6水平回降(P<0.05),且随剂量升高其回降越明显;Nrf2抑制剂组大鼠血清TNF-α、IL-6升高(P<0.05)(表3)。
2.6 黄芪甲苷Ⅳ对大鼠肾组织Nrf2及CD31阳性共表达的影响
与假手术组相比,模型组大鼠肾组织Nrf2+CD31+水平升高(P<0.05)。与模型组相比,黄芪甲苷低、高剂量组大鼠肾组织Nrf2+CD31+水平进一步升高(P<0.05),且随剂量升高其升高越明显;Nrf2抑制剂组大鼠血清Nrf2+CD31+水平回降(P<0.05)(图3,表4)。
2.7 黄芪甲苷Ⅳ对大鼠肾组织HO-1及VEGF阳性表达的影响
假手术组大鼠肾小管上皮细胞区域、肾小球内皮细胞区域及肾小球系膜细胞区域HO-1及eNOS染色较弱。与假手术组相比,模型组大鼠肾组织上述区域eNOS及HO-1阳性表达升高(P<0.05);与模型组相比,黄芪甲苷低、高剂量组大鼠肾组织eNOS阳性表达降低(P<0.05),HO-1阳性表达升高(P<0.05),且黄芪甲苷剂量越高上述指标变化越明显;Nrf2抑制剂组eNOS阳性表达升高(P<0.05),HO-1阳性表达降低(P<0.05)(图4,表5)。
2.8 黄芪甲苷Ⅳ对大鼠肾组织ANGPTL6、MCP-1蛋白表达的影响
与假手术组相比,模型组大鼠肾组织ANGPTL6、MCP-1表达升高(P<0.05)。与模型组相比,黄芪甲苷低、高剂量组大鼠肾组织ANGPTL6、MCP-1表达回降(P<0.05),且黄芪甲苷剂量越高上述指标变化越明显;Nrf2抑制剂组大鼠肾组织ANGPTL6、MCP-1表达升高(P<0.05)(图5,表6)。
3、讨论
肾血管微循环结构或功能损坏可引起肾小球、肾小管及肾间质损害[8]。低氧条件及炎性刺激下,肾小管周毛细血管更易受到损害[9]。尿毒症患者血液中Scr、BUN、β2-MG等毒素大量积聚,是导致血管内皮功能失调的主要原因[10]。另外,尿毒症患者体内炎性因子IL-6、TNF-α升高,可促进红细胞在毛细血管管腔积聚、引起血管内皮功能损伤、导致肾毛细血管血流中断,而加重肾损伤[11]。本研究发现,模型组大鼠血清Scr、BUN、β2-MG等毒素及炎性因子IL-6、TNF-α升高的同时,肾小管周毛细血管管腔红细胞聚集、内皮细胞肿胀及增大等肾血管病变加重,预示模型造模成功。
炎性因子TNF-α、IL-6还可激活细胞外信号调节激酶(ERK)通路激活来调控炎症及氧化应激反应,并促进血管内皮及组织损伤。炎性因子及氧化应激均可促进肾组织及内皮细胞释放ANGPTL6,并通过激活ERK-eNOS信号通路,来促进内皮细胞释放NO,诱导肾小球及肾小管血管内皮细胞释放MCP-1来诱导炎性细胞聚集,从而加重肾脏血管病变[12]。本研究发现模型组大鼠肾组织中ANGPTL6、MCP-1表达升高的同时,eNOS表达也明显升高,提示ANGPTL6/eNOS/MCP-1可能与肾血管内皮损伤关系密切。
Nrf2//HO-1通路是抵御外界炎性反应及氧化应激的防御性传导通路,且与肾损伤关系密切。研究证实,ERK磷酸化,可促进Nrf2释放并激活抗氧化酶如HO-1表达,来抑制ROS水平升高,发挥抗氧化反应[13,14]。本研究发现,模型组大鼠Nrf2/HO-1在血管内皮细胞中表达升高,而用Nrf2/HO-1通路抑制剂阻断Nrf2/HO-1表达后,大鼠死亡、肾组织炎性损伤、肾血管病变进一步加重,提示抑制Nrf2/HO-1通路活化,可加重肾血管内皮损伤。黄芪甲苷Ⅳ对肾脏具有保护作用,能抑制体外培养的人血管内皮细胞凋亡[15]。本研究发现随着黄芪甲苷Ⅳ剂量的升高,大鼠肾组织Nrf2/HO-1激活;大鼠肾组织炎性及氧化应激损伤、肾血管内皮损伤缓解越明显,提示黄芪甲苷Ⅳ发挥抗尿毒症肾损伤作用,可能与激活Nrf2/HO-1通路有关。Nrf2抑制剂可逆转黄芪甲苷Ⅳ上述作用。
综上所述,黄芪甲苷Ⅳ可能通过促进Nrf2/HO-1通路介导的抗炎、抗氧化途径激活,减轻尿毒症大鼠肾血管内皮损伤。为阐明黄芪甲苷保护尿毒症肾损伤的机制提供了新的可能机制,但尿毒症肾血管内皮损伤的机制复杂,还涉及自噬过程,黄芪甲苷Ⅳ保护尿毒症肾血管损伤的其他可能机制还有待进一步深入研究。
参考文献:
[2]黄梦杰,魏日胞.尿毒症毒素与血管内皮功能损伤研究新进展[J].中国中西医结合肾病杂志,2018,19:167-169.
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[10]齐玲,孔祥栋,盛丹虹,等.不同透析方式对尿毒症患者血管内皮细胞功能、微炎症状态及心血管并发症的影响[J].浙江医学,2018,40.62-64.
[15]崔伟,王高频,卢美丽,等.黄芪甲苷通过激活PI3KI/AKT通路抑制内皮细胞内质网应激介导的细胞凋亡的研究[J].中药药理与临床,2018,34.39-4
文章来源:朱文胜,郑忠毓,李晓霞,邓建南,张吉春.黄芪甲苷Ⅳ减轻尿毒症模型大鼠肾血管内皮损伤[J].基础医学与临床,2021,41(11):1629-1636.
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尿毒症是急慢性肾衰竭的晚期,此时肾脏无法发挥正常的功能,导致患者出现水、电解质、酸碱平衡紊乱和肾脏内分泌功能失调,还会出现代谢终末产物和毒性物质在体内大量潴留。患者早期症状为纳差、恶心、呕吐等,如未控制治疗、病情不断加重可并发心血管疾病,其病死风险较高。
2024-04-08尿毒症患者肾单位出现慢性、进行性、不可逆性破坏,而残存肾单位不足以排除代谢废物,导致体内肌酐、尿素等尿毒素蓄积,并引起体液、电解质和激素失衡。血液透析是治疗尿毒症的有效手段,能减轻毒素蓄积和纠正酸碱电解质失衡。同时随着血液净化技术的不断发展,尿毒症患者的长期生存成为可能,但血液透析造福患者的同时也引发了相关负面问题。
2024-03-15慢性尿毒症为肾内科常见疾病,患者主要会受到糖尿病、肾炎综合征、高血压等因素影响,引发疾病,增加死亡风险。针对该种疾病主要会按照患者实际情况合理选择保肾药物、血液透析、肾移植等方式帮助患者控制病情发展。其中,血液透析为常用治疗手段,利用相关装置,将患者机体中血液引出,借助弥散、超滤、吸附以及对流原理,实现血液中物质交换。
2024-02-02尿毒症(uremia,URE)是慢性肾脏病的终末阶段,也是急性肾损伤发展的最后状态。急性肾损伤若不及时有效地治疗,随着疾病的进展会出现恶化或延迟,进而发展为慢性肾功能不全、肾功能衰竭,最终发展为URE。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)是NF-κB上游的信号通路,抑制p38MAPK/NF-κB信号通路的激活能减轻5/6肾切除大鼠炎症反应和肾损伤[5]。
2024-02-01尿毒症是肾脏疾病终末期,典型症状包括食欲不振、倦怠乏力、水肿,其发病主要与水、电解质、酸碱平衡紊乱及内分泌功能障碍等因素有关,吸烟、营养不良、严重感染等因素亦能在一定程度上促使尿毒症渐进性发展,从而危及患者健康[1,2]。尿毒症属于中医“肾劳”“水肿”等范畴,发病是以正虚为本、热毒为标的本虚标实之证,治宜清热解毒、消肿利水[3]。
2024-02-01尿毒症性皮肤瘙痒症是维持性血液透析患者常见的并发症之一,发生率60%~90%,以局部或全身性瘙痒、脱屑等为主要表现,不仅会导致溃烂、结节性痒疹等继发性皮肤损害,还影响了患者生活和睡眠质量。有研究表明,约60%的尿毒症性皮肤瘙痒症患者伴有睡眠障碍。同时,也是导致患者焦虑、抑郁和增加死亡风险的独立危险因素。
2023-07-19尿毒症性皮肤瘙痒症是维持性血液透析患者常见的并发症之一,发生率60%~90%,以局部或全身性瘙痒、脱屑等为主要表现,不仅会导致溃烂、结节性痒疹等继发性皮肤损害,还影响了患者生活和睡眠质量。有研究表明,约60%的尿毒症性皮肤瘙痒症患者伴有睡眠障碍。同时,也是导致患者焦虑、抑郁和增加死亡风险的独立危险因素。
2023-07-17非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)是一种由补体失调引起的血栓性微血管病(TMA),其表现为微血管病性溶血性贫血、血小板减少和终末器官损害(主要是肾脏)三联征。它发生于各个年龄段,以儿童期发病为主,其次为妊娠引起发病。其预后不良,死亡率高,属于罕见病中的疑难问题。长期以来,aHUS的诊断与治疗困扰着人们,这也促进了医学人士对此病的研究。
2022-06-28尿毒症是各种慢性肾病发展到终末期的共同征象,患者肾功能严重受损,需予以肾脏替代疗法进行治疗,以维持其生命[1]。腹膜透析是尿毒症患者常用肾脏替代疗法,通过对患者肾脏功能进行替代,可实现对残余肾功能的有效保护,但接受腹膜透析期间,患者容易出现容量失衡的情况,致使心血管并发症发生的风险增加[2]。
2021-12-10尿毒症是指终末期肾病出现的一系列临床症状,随着我国老年人口的不断增长,尿毒症的发生率也不断升高,皮肤瘙痒作为尿毒症常见并发症,是导致患者生活质量下降的主要原因之一。皮肤瘙痒不但导致患者失眠,甚至导致患者出现心理障碍,导致患者身心健康受到严重影响。
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