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黄芪甲苷Ⅳ减轻尿毒症模型大鼠肾血管内皮损伤

2021-11-08 124 上传者：管理员

摘要：目的探讨黄芪甲苷Ⅳ通过调控核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶-1(HO-1)信号通路对尿毒症模型大鼠血管内皮的保护作用。方法将大鼠分为假手术组、模型组、黄芪甲苷低(100mg/kg)、高(200mg/kg)剂量组、Nrf2抑制剂组(2mg/kg)、黄芪甲苷高剂量+Nrf2抑制剂(200mg/kg+2mg/kg)组,每组12只。各组腹腔注射干预给药结束后,用酶联免疫吸附法(ELISA)测血清肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)、血β2-微球蛋白(β2-MG)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;透射电镜观察肾组织血管结构病变;免疫荧光法检测活性氧簇(ROS);免疫荧光共定位法测血管内皮标志物CD31与Nrf2在肾组织中表达;免疫组化法检测肾组织HO-1及血管内皮损伤相关标志物-内皮型一氧化氮(eNOS)在肾组织中表达;蛋白免疫印迹法检测血管生成素样蛋白6(ANGPTL6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达。结果与假手术组相比,模型组大鼠肾小管周毛细血管管腔红细胞聚集、内皮细胞肿胀及增大、管腔狭窄及受压严重;Scr、BUN、β2-MG、TNF-α及IL-6等分泌量变化明显(P<0.05);肾组织ROS、肾血管组织HO-1及eNOS阳性表达;CD31与Nrf2阳性共表达、肾组织ANGPTL6及MCP-1蛋白表达水平均升高(P<0.05)。与模型组相比,黄芪甲苷低、高剂量组大鼠肾小管周毛细血管管腔红细胞聚集、内皮细胞肿胀及增大缓解;血清毒素及炎性因子水平、肾组织ROS、肾血管内皮损伤相关蛋白ANGPTL6、MCP-1、eNOS表达降低(P<0.05);肾血管组织HO-1、CD31与Nrf2阳性共表达水平均升高(P<0.05);Nrf2抑制剂组大鼠肾小管周毛细血管管腔红细胞聚集、内皮细胞肿胀、增大进一步加重。上述指标变化趋势与黄芪甲苷Ⅳ剂量组相反(P<0.05)。结论黄芪甲苷Ⅳ可能通过促进Nrf2/HO-1通路介导的抗炎、抗氧化途径激活,减轻尿毒症大鼠肾血管内皮损伤。

关键词：
临床综合征
尿毒症
核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶-1(HO-1)信号通路
血管内皮
黄芪甲苷Ⅳ
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尿毒症(uremia)是各种晚期的肾脏病共有的临床综合征。在中国，尿毒症发病率和病死率随着老龄化人口的增加而不断上升[1]。目前研究发现，血管内皮功能障碍，是尿毒症的首要死亡原因，也是临床研究的重点和难点问题[2]。核因子E2相关因子2(nuclearfactor-E2-relatedfactor2,Nrf2)/血红素氧合酶-1(hemeoxygenase1,HO-1)在细胞抗氧化损伤和抗炎性损伤过程中发挥主要作用，并参与血管内皮损伤过程[3]。黄芪甲苷Ⅳ(astragalosideⅣ)是中药黄芪的主要活性成分，具有抗炎、降血脂、改善糖尿病引起的血管病变和心肌病等作用[4],但其作用机制尚不清楚，本文通过肾脏切除法建立大鼠尿毒症模型，对此进行探讨。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：

SPF级SD雄性大鼠，体质量：220～240g[广东省医学实验动物中心，生产许可证号为SCXK(粤)2016-0002],动物质量合格证号为省科委2000A027。

1.1.2 主要试剂

黄芪甲苷Ⅳ(上海阿拉丁生化科技有限公司);Nrf2抑制剂(MedchemExpress公司);白细胞介素-6(IL-6)酶联免疫(ELISA)试剂盒和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司);肌酐(Scr)ELISA试剂盒(上海一研生物科技有限公司);尿素氮(bloodureanitrogen,BUN)ELISA试剂盒(上海雅吉生物科技有限公司);血β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)ELISA试剂盒(上海研生实业有限公司);兔抗大鼠一抗Nrf2、HO-1(ProteinechGroup公司);小鼠抗CD31、兔抗内皮型一氧化氮(endothelialnitricoxidesynthase,eNOS)、血管生成素样蛋白6(angiopoietinlikeprotein6,ANGPTL6)、单核细胞趋化蛋白-1(monocytechemotacticprotein-1,MCP-1)等抗体(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：

取70只大鼠，按文献[5]方法切除占肾脏1/3的上极和下极左肾肾脏，术后1周进行完全摘除右肾手术，制备尿毒症模型，4周后大鼠成活，随机取2只大鼠剩余肾脏进行镜检，若出现肾血管内皮出现水肿、增大现象，视为造模成功，共造模成功60只(有3只于术后1周死亡，2只术后3周死亡，3只手术失败死亡),将造模成功的大鼠随机分为模型组、黄芪甲苷低(100mg/kg)、高(200mg/kg)剂量组、Nrf2抑制剂组(2mg/kg)、黄芪甲苷+Nrf2抑制剂组(200mg/kg+2mg/kg),每组12只。另取12只大鼠，仅行麻醉和暴露双肾，不做手术切除，作为假手术组。黄芪甲苷及Nrf2抑制剂参照文献[6,7]设置剂量，用0.9%氯化钠溶液稀释成为10.0、20.0、0.2mg/mL的混悬液，按10mL/kg的剂量腹腔注射给药，黄芪甲苷给药3次/d,Nrf2抑制剂给药1次/d;黄芪甲苷+Nrf2抑制剂组给予黄芪甲苷的同时腹腔注射给予Nrf2抑制剂；假手术组及模型组给予等量0.9%氯化钠溶液，各组均连续给药4周，给药期间观察大鼠行为及死亡状况。

1.2.2 采集标本及透射电镜观察肾血管病变：

末次给药12h后，麻醉大鼠，取腹主动脉血3mL,3000r/min离心10min后，取上清液于-20℃冰箱保存备用。处死大鼠，解剖取剩余肾脏组织，经磷酸缓冲盐冲洗后，切取肾组织0.5g置于-80℃冰箱保存，剩余肾组织分成2部分，一部分送于电镜室进行镜检并观察拍照；另一部分制成冰冻切片备用。

1.2.3 ELISA检测大鼠血清Scr、BUN、β2-MG、TNF-α、IL-6水平：

以ELISA试剂盒说明书方法检测Scr、BUN、β2-MG及血清TNF-α、IL-6水平。

1.2.4 免疫荧光检测肾组织ROS蓄积水平：

取部分新鲜冰冻切片，加入二氢乙啶(dihydroethidium,DHE)探针并于室温下孵育20min后，置于荧光显微镜下观察组织染色情况。并随机取5个视野，用ImageProPlus5.0图像分析系统以单位面积内绿色荧光强度强弱代表细胞中ROS相对水平。

1.2.5 免疫荧光检测CD31与Nrf2在肾组织中表达：

取切片，加入特丁基对苯二酚及0.25%曲拉通(TritonX-100)处理透化后，加入一抗(兔抗鼠Nrf2、小鼠抗大鼠CD31,(1∶200))4℃孵育过夜，加入二抗(TRITC标记的山羊抗兔IgG、FITC标记的山羊抗小鼠IgG,稀释倍数为1∶200)孵育显色后，用防猝灭液封片后于激光共聚焦显微镜下观察，拍照。

1.2.6 免疫组化法检测肾组织HO-1、eNOS阳性表达：

抗原修复后，加入一抗抗体(HO-1、eNOS,1∶500)室温孵育过夜后，加入羊抗兔二抗(1∶1000)室温孵育后，加DAB显色、苏木精复染封片后于光镜下拍照，随机取5个视野，观察肾组织血管染色情况，并采用ImageProPlus5.0图像分析系统分析被染成棕黄色的区域域面积，结果以5个视野阳性表达的平均吸光度值表示。

1.2.7 Westernblot检测大鼠肾组织ANGPTL6、MCP-1蛋白表达水平：

将-80℃冻存的肾组织，4℃解冻后，于冰上用组织匀浆器匀浆，离心分离后，用蛋白提取试剂盒提取蛋白，BCA法检测蛋白浓度后，取50μL进行电泳和转膜反应，并加入一抗(ANGPTL6、MCP-1(1∶1000),β-actin(内参，1∶2000)抗体4℃孵育过夜，加入HRP标记的羊抗兔二抗溶液(1∶2000)室温孵育4h,用化学发光法显色，以化学发光仪观察条带并拍照。

1.3 统计学分析

以SPSS22.0软件对实验数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差(x¯±s)表示，组间比较进行单因素方差分析，进一步两组间比较行SNK-q检验。

2、结果

2.1 黄芪甲苷Ⅳ对大鼠一般行为的影响

假手术组大鼠无死亡。模型组、黄芪甲苷+Nrf2抑制剂组有3只死亡，大鼠形体消瘦、生长缓慢，饮食较少。黄芪甲苷低、高剂量组大鼠给药期间无死亡，且体重减轻及饮食减少现象有所改善。Nrf2抑制剂组有5只死亡，且体质量减轻、饮食减少现象进一步加重。

2.2 黄芪甲苷Ⅳ对大鼠血清Scr、BUN、β2-MG水平的影响

与假手术组相比，模型大鼠血清Scr、BUN、β2-MG水平升高(P<0.05)。与模型组相比，黄芪甲苷低、高剂量组大鼠血清Scr、BUN、β2-MG水平回降(P<0.05),且高剂量组优于低剂量组；Nrf2抑制剂组大鼠血清Scr、BUN、β2-MG水平升高(P<0.05)(表1)。

2.3 黄芪甲苷Ⅳ对大鼠肾组织病理损伤的影响

假手术组大鼠肾小管毛细血管周结构正常；与假手术组相比，模型组大鼠肾小管周毛细血管管腔红细胞聚集、内皮细胞肿胀及增大、管腔狭窄及受压明显；与模型组相比，Nrf2抑制剂组肾小管周毛细血管管腔红细胞聚集、内皮细胞肿胀及增大进一步增加；黄芪甲苷低、高剂量组大鼠上述病理损伤减轻明显，且随黄芪甲苷剂量增加上述病理损伤改善越显著；黄芪甲苷+Nrf2抑制剂组上述病理损伤与模型组相近(图1)。

2.4 黄芪甲苷Ⅳ对大鼠肾组织ROS水平的影响

与假手术组相比，模型组大鼠肾组织ROS水平升高(P<0.05)。与模型组相比，黄芪甲苷低、高剂量组大鼠肾组织ROS水平回降(P<0.05),且随剂量升高其回降越明显；Nrf2抑制剂组大鼠肾组织ROS水平升高(P<0.05)(图2,表2)。

2.5 黄芪甲苷Ⅳ对大鼠血清TNF-α、IL-6水平的影响

与假手术组相比，模型组大鼠血清TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)。与模型组相比，黄芪甲苷低、高剂量组大鼠血清TNF-α、IL-6水平回降(P<0.05),且随剂量升高其回降越明显；Nrf2抑制剂组大鼠血清TNF-α、IL-6升高(P<0.05)(表3)。

2.6 黄芪甲苷Ⅳ对大鼠肾组织Nrf2及CD31阳性共表达的影响

与假手术组相比，模型组大鼠肾组织Nrf2+CD31+水平升高(P<0.05)。与模型组相比，黄芪甲苷低、高剂量组大鼠肾组织Nrf2+CD31+水平进一步升高(P<0.05),且随剂量升高其升高越明显；Nrf2抑制剂组大鼠血清Nrf2+CD31+水平回降(P<0.05)(图3,表4)。

2.7 黄芪甲苷Ⅳ对大鼠肾组织HO-1及VEGF阳性表达的影响

假手术组大鼠肾小管上皮细胞区域、肾小球内皮细胞区域及肾小球系膜细胞区域HO-1及eNOS染色较弱。与假手术组相比，模型组大鼠肾组织上述区域eNOS及HO-1阳性表达升高(P<0.05);与模型组相比，黄芪甲苷低、高剂量组大鼠肾组织eNOS阳性表达降低(P<0.05),HO-1阳性表达升高(P<0.05),且黄芪甲苷剂量越高上述指标变化越明显；Nrf2抑制剂组eNOS阳性表达升高(P<0.05),HO-1阳性表达降低(P<0.05)(图4,表5)。

2.8 黄芪甲苷Ⅳ对大鼠肾组织ANGPTL6、MCP-1蛋白表达的影响

与假手术组相比，模型组大鼠肾组织ANGPTL6、MCP-1表达升高(P<0.05)。与模型组相比，黄芪甲苷低、高剂量组大鼠肾组织ANGPTL6、MCP-1表达回降(P<0.05),且黄芪甲苷剂量越高上述指标变化越明显；Nrf2抑制剂组大鼠肾组织ANGPTL6、MCP-1表达升高(P<0.05)(图5,表6)。

3、讨论

肾血管微循环结构或功能损坏可引起肾小球、肾小管及肾间质损害[8]。低氧条件及炎性刺激下，肾小管周毛细血管更易受到损害[9]。尿毒症患者血液中Scr、BUN、β2-MG等毒素大量积聚，是导致血管内皮功能失调的主要原因[10]。另外，尿毒症患者体内炎性因子IL-6、TNF-α升高，可促进红细胞在毛细血管管腔积聚、引起血管内皮功能损伤、导致肾毛细血管血流中断，而加重肾损伤[11]。本研究发现，模型组大鼠血清Scr、BUN、β2-MG等毒素及炎性因子IL-6、TNF-α升高的同时，肾小管周毛细血管管腔红细胞聚集、内皮细胞肿胀及增大等肾血管病变加重，预示模型造模成功。

炎性因子TNF-α、IL-6还可激活细胞外信号调节激酶(ERK)通路激活来调控炎症及氧化应激反应，并促进血管内皮及组织损伤。炎性因子及氧化应激均可促进肾组织及内皮细胞释放ANGPTL6,并通过激活ERK-eNOS信号通路，来促进内皮细胞释放NO,诱导肾小球及肾小管血管内皮细胞释放MCP-1来诱导炎性细胞聚集，从而加重肾脏血管病变[12]。本研究发现模型组大鼠肾组织中ANGPTL6、MCP-1表达升高的同时，eNOS表达也明显升高，提示ANGPTL6/eNOS/MCP-1可能与肾血管内皮损伤关系密切。

Nrf2//HO-1通路是抵御外界炎性反应及氧化应激的防御性传导通路，且与肾损伤关系密切。研究证实，ERK磷酸化，可促进Nrf2释放并激活抗氧化酶如HO-1表达，来抑制ROS水平升高，发挥抗氧化反应[13,14]。本研究发现，模型组大鼠Nrf2/HO-1在血管内皮细胞中表达升高，而用Nrf2/HO-1通路抑制剂阻断Nrf2/HO-1表达后，大鼠死亡、肾组织炎性损伤、肾血管病变进一步加重，提示抑制Nrf2/HO-1通路活化，可加重肾血管内皮损伤。黄芪甲苷Ⅳ对肾脏具有保护作用，能抑制体外培养的人血管内皮细胞凋亡[15]。本研究发现随着黄芪甲苷Ⅳ剂量的升高，大鼠肾组织Nrf2/HO-1激活；大鼠肾组织炎性及氧化应激损伤、肾血管内皮损伤缓解越明显，提示黄芪甲苷Ⅳ发挥抗尿毒症肾损伤作用，可能与激活Nrf2/HO-1通路有关。Nrf2抑制剂可逆转黄芪甲苷Ⅳ上述作用。

综上所述，黄芪甲苷Ⅳ可能通过促进Nrf2/HO-1通路介导的抗炎、抗氧化途径激活，减轻尿毒症大鼠肾血管内皮损伤。为阐明黄芪甲苷保护尿毒症肾损伤的机制提供了新的可能机制，但尿毒症肾血管内皮损伤的机制复杂，还涉及自噬过程，黄芪甲苷Ⅳ保护尿毒症肾血管损伤的其他可能机制还有待进一步深入研究。

参考文献:

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文章来源：朱文胜,郑忠毓,李晓霞,邓建南,张吉春.黄芪甲苷Ⅳ减轻尿毒症模型大鼠肾血管内皮损伤[J].基础医学与临床,2021,41(11):1629-1636.