多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是一种内分泌紊乱性疾病，以胰岛素抵抗、慢性无排卵、高雄激素为特征，主要表现为月经失调、不孕、肥胖等[1]。随着分子生物学不断发展，有学者[2]发现，存在于卵巢中的一些调节因子可能参与PCOS发生、发展。转录因子GATA结合蛋白4(GATA-binding protein 4,GATA4)是一类重要的转录调节因子，可参与卵巢组织中卵泡发育，调节卵巢颗粒细胞凋亡[3]。有研究发现，卵巢颗粒细胞的增殖与分化是卵泡发育的根本原因，而其凋亡与退化则会导致卵泡闭锁[4]。张琼等[5]研究显示，沉默PCOS大鼠卵巢颗粒细胞中GATA4表达，可上调活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)、下调Wnt/β-环化蛋白信号通路，促进细胞凋亡。但GATA4表达对PCOS卵巢颗粒细胞是否还存在其他方面的影响尚不清楚。炎症反应在卵泡和黄体期对卵巢的正常活动有重要的调节作用，有 研究显示，GATA4可调控椎间盘髓核细胞发生炎 症[6]。然而GATA4表达是否可调控PCOS炎症反应仍有待明确。因此，本研究将深入分析沉默GATA4表达对PCOS大鼠卵巢颗粒细胞凋亡、分泌功能及炎症反应的影响，并初步分析相关机制，为此病的分子治疗提供参考。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验材料

健康SD大鼠1只，SPF级，雌性，6周龄，体质量158 g,购于上海睿太莫斯生物科技有限公司，生产许可SCXK(沪)2016-0001。

1.1.2试剂

脱氢表雄酮，纯度>98%,武汉东康源科技有限公司；注射用油，四川科伦药物研究院有限公司；LipofectamineTM2000试剂盒，济南舜腾生物技术有限公司；GATA4单克隆抗体一抗，北京奥维亚生物技术有限公司；活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)单克隆抗体一抗，美国Trevigen公司；磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)单克隆抗体一抗，上海信裕生物科技有限公司；磷酸化的丝氨酸苏氨酸激酶(p-serine threonine kinase, p-AKT)单克隆抗体一抗，北京中杉金桥生物有限公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)单克隆抗体一抗，北京普利莱基因技术有限公司；山羊抗兔二抗，北京博尔迈生物技术公司；CCK-8试剂，上海锐赛生物技术有限公司；异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡检测试剂盒，南京森贝伽生物科技有限公司；大鼠雌二醇(estradiol, E2)、黄体生成素(luteinizing hormone, LH)、睾酮(testosterone, T)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、IL-1β及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测试剂 盒，江苏酶免实业有限公司。

1.1.3仪器

倒置显微镜，型号：CKX53,日本OLYMPUS公司；流式细胞仪，型号：FACSCalibur,北京科誉兴业科技发展有限公司；酶标仪，型号：iMARK,美国Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1多囊卵巢综合征模型制备

SD大鼠适应性喂养7 d后，肌肉注射6 mg/100 g脱氢表雄酮和0.2 mL注射用油，发现大鼠血胰岛素、睾酮水平增加且阴道涂片检查持续出现角化细胞、失去动情周期，则视为多囊卵巢综合征模型制备成功[7]。

1.2.2卵巢颗粒细胞原代培养

造模成功21 d后，大鼠禁食12 h,处死，摘取卵巢组织，倒置显微镜下去除卵巢表面包膜及周围脂肪组织，0.9% NaCl溶液冲洗表面红细胞，置于不含血清的DMEM/F12细胞培养基中，并用1 mL空针头刺破卵泡，释放卵泡颗粒细胞，轻轻吹打卵泡颗粒细胞使之分散，过滤，离心，弃上清，收集颗粒细胞，采用流式细胞仪检测颗粒细胞纯度，直至颗粒细胞纯度达到95%。向分离得到的颗粒细胞中加入含15%胎牛血清的DMEM/F12培养基，37℃、5% CO2培养，细胞贴壁后换液，继续培养至细胞生长密度达80%以上时进行消化、传代。

1.2.3细胞转染

转染前24 h将对数期卵巢颗粒细胞接种培养，使细胞生长密度达90%以上，将卵巢颗粒细胞随机分为对照组(Ctrl组)、siRNA-NC组、siRNA-GATA4组，Ctrl组不做任何处理，siRNA-NC组转染10 nmol/L无关干扰序列，siRNA-GATA4组转染10 nmol/L GATA4-siRNA,转染结束后继续培养48 h,转染操作按照LipofectamineTM2000转染说明进行。

1.2.4 Western Blotting法检测GATA4、cleaved caspase-3、PI3K、p-AKT蛋白表达

取转染后的上述三组细胞，加细胞裂解液，匀浆，离心，提取蛋白，使用BCA试剂盒对蛋白进行定量，取总蛋白上样，电泳，切胶，转膜，封闭，加入GATA4(稀释1∶300)、cleaved caspase-3(稀释1∶200)、PI3K(稀释1∶100)、p-AKT(稀释1∶100)、GAPDH(稀释1∶1 000)单克隆抗体一抗，4℃孵育过夜，洗膜，加山羊抗兔二抗，37℃孵育60 min,洗膜，ECL发光试剂盒显色，洗片后显影、定影，以GAPDH为内参蛋白，分析GATA4、cleaved caspase-3、PI3K、p-AKT蛋白表达，实验重复3次。

1.2.5 CCK-8法检测细胞增殖情况

取转染后的上述三组细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制备细胞悬液，加样至细胞培养板中，并加入10μL CCK-8溶液，37℃避光孵育4 h,各孔光密度(optical density, OD)值测定前用空白对照孔 调零，调零完成后采用酶标 仪在450 nm波长处测定OD值，记录数据，计算细胞增殖率，细胞增殖率=(实验组细胞OD/空白对照组细胞OD)×100%,实验重复3次。

1.2.6流式细胞术检测细胞凋亡

取转染后的上述三组细胞，制成细胞悬液，计算细胞悬液浓度，稀释至1×106细胞/mL,结合缓冲液悬浮细胞。流式管中依次加入100μL细胞悬液、5μL PI和5μL Annexin V-FITC,混匀，25℃避光反应15 min, 60 min内上流式细胞仪检测细胞凋亡情况，实验重复3次。

1.2.7 ELISA检测激素和炎症因子含量

取转染后的上述三组细胞上清液，参照ELISA试剂盒说明书操作，测定上清液中E2、LH、T、IL-6、IL-1β及TNF-α含量。

1.2.8统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1转染后三组卵巢颗粒细胞中GATA4蛋白表达

siRNA-GATA4组卵巢颗粒细胞中GATA4蛋白表达量较Ctrl组明显减少，差异有统计学意义(P<0.05);siRNA-NC组与Ctrl组卵巢颗粒细胞中GATA4蛋白表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05,图1)。

2.2转染后三组卵巢颗粒细胞增殖情况

siRNA-GATA4组卵巢颗粒细胞增殖率较Ctrl组明显下降，差异有统计学意义(P<0.05),siRNA-NC组与Ctrl组卵巢颗粒细胞增殖率比较，差异无统计学意义(P>0.05,图2)。

2.3转染后三组卵巢颗粒细胞凋亡情况

siRNA-GATA4组卵巢颗粒细胞凋亡率和cleaved caspase-3蛋白表达量较Ctrl组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05),siRNA-NC组与Ctrl组卵巢颗粒细胞凋亡率和cleaved caspase-3蛋白表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05,图3)。

图1转染后三组卵巢颗粒细胞中GATA4蛋白表达

图2转染后三组卵巢颗粒细胞增殖率

图3转染后三组卵巢颗粒细胞凋亡情况

2.4转染后三组卵巢颗粒细胞上清液中激素含量

siRNA-GATA4组卵巢颗粒细胞上清液中E2、LH和T水平较Ctrl组明显升高，差异有统计 学意义(P<0.05),siRNA-NC组与Ctrl组卵巢颗粒细胞中E2、LH和T水平比较，差异无统计学意义(P>0.05,图4)。

2.5转染后三组卵巢颗粒细胞上清液中炎症因子含量

siRNA-GATA4组卵巢颗粒细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平较Ctrl组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05),siRNA-NC组与Ctrl组卵巢颗粒细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平比较，差异无统计学意义(P>0.05,图5)。

图4转染后三组卵巢颗粒细胞上清液中激素含量

图5转染后三组卵巢颗粒细胞上清液中激素含量

2.6转染后三组卵巢颗粒细胞中PI3K、p-AKT蛋白表达

siRNA-GATA4组卵巢颗粒细胞中PI3K、p-AKT蛋白表达量较Ctrl组明显减少，差异有统计学意义(P<0.05),siRNA-NC组与Ctrl组卵巢颗粒细胞中PI3K、p-AKT蛋白表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05,图6)。

3、讨论

GATA4定位于大鼠14号染色体，是一种多功能的转录因子，主要表达于大鼠卵泡、卵巢及黄体中，可通过激活其El标基因转录影响颗粒细胞多肽激素合成，从而调节卵泡发育[8]。GATA4还可激活类固醇激素合成急性调控蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR),介导线粒体外的胆固醇(cholesterol)转移至线粒体内膜，从而促进孕烯醇酮(gestenolone)合成[9]。

图6转染后三组卵巢颗粒细胞PI3K、p-AKT蛋白表达

SARWAR等[10]研究发现，哺乳动物的卵巢颗粒细胞中有GATA4表达，且卵巢颗粒细胞增殖活性随GATA4表达的增加而升高。RNA干扰为一种有效的基因阻断技术，由双链RNA介导，能使内源mRNA特异性降解，目前已广泛应用于基因功能、基因治疗的研究[11]。本研究通过RNA干扰技术沉默GATA4在PCOS大鼠中的表达，研究其对卵巢颗粒细胞增殖与凋亡的影响，结果显示沉默PCOS大鼠卵巢颗粒细胞中GATA4表达后，细胞增殖率下降，细胞凋亡率增加，这与既往研究[5]结果相符。提示沉默PCOS大鼠模型中GATA4表达，可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。caspase-3属于caspase家族，是细胞凋亡过程中的效应蛋白，也是caspase级联反应下游的关键酶，正常情况下caspase-3无活性，经切割活化后提示细胞进入凋亡不可逆阶段[12]。本研究发现siRNA-GATA4组卵巢颗粒细胞中cleaved caspase-3较Ctrl组明显增多，提示沉默多囊卵巢综合征大鼠模型中GATA4表达，可上调cleaved caspase-3蛋白表达，促进细胞凋亡。

PCOS属于生殖障碍与代谢紊乱并存的疾病，激素水平紊乱与月经失调、不孕、肥胖等症状密切相关[13]。本研究发现，siRNA-GATA4组卵巢颗粒细胞上清液中E2、LH和T水平较Ctrl组明显升高，表明沉默多囊卵巢综合征大鼠模型中GATA4表达后，激素分泌异常的现象进一步加重，阻碍卵泡的发育和成熟。有研究表明[14],PCOS患者体内炎症反应水平升高。基础研究发现[15],炎症因子可影响卵巢颗粒细胞的增殖与凋亡，损害卵泡发育的精细调节。本研究中，siRNA-GATA4组卵巢颗粒细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平较Ctrl组明显升高，提示沉默多囊卵巢综合征大鼠模型中GATA4表达，可促进炎症因子表达。

相关研究[16-17]认为，PI3K/AKT信号通路相关蛋白磷酸化增强是细胞增殖的重要分子机制之一。PI3K是一种具有丝氨酸/苏氨酸(serine/threonine, Ser/Thr)激酶活性的胞内磷脂酰肌醇激酶，其介导的信号通路可参与细胞增殖、分化。AKT是PI3K的下游效应基因，其磷酸化后可调节蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的底物蛋白，进而调控细胞生理过程[18]。另外，PI3K/AKT信号通路还是机体免疫反应的重要调节通路，可调节炎症因子的分泌，引起肿瘤细胞异常增殖、凋亡[19]。有文献[20]报道，PI3K/AKT信号通路与PCOS患者胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)、脂肪细胞增殖有密切关系。本研究采用Western Blotting法检测转染后三组卵巢颗粒细胞中PI3K、p-AKT蛋白表达，发现siRNA-GATA4组卵巢颗粒细胞中PI3K、p-AKT蛋白表达量较Ctrl组明显减少，提示沉默多囊卵巢综合征大鼠模型中GATA4表达，可下调PI3K、p-AKT蛋白表达。故猜测沉默PCOS大鼠模型中GATA4表达后对卵巢颗粒细胞的影响，可能通过下调PI3K/AKT信号通路实现。

沉默多囊卵巢综合征大鼠模型中GATA4表达，可抑制卵巢颗粒细胞增殖，促进其凋亡，加剧激素分泌异常和炎症反应，其机制可能与下调PI3K/AKT信号通路有关。

参考文献:

[3]李凯,王永红.复方甘芍贴剂对多囊卵巢综合征模型大鼠卵巢颗粒细胞转录因子GATA结合蛋白4表达的影响及意义[J].中国生育健康杂志,2015,26(3):272-274.

[5]张琼,胡静,唐向辉.GATA4基因沉默对多囊卵巢综合征模式大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响及相关机制[J].现代妇产科进展,2017,26(11):957-859.

[6]罗力文,简秀英,周跃.GATA4调控NF-κB信号通路促进椎间盘髓核细胞发生炎症和衰老[J].免疫学杂志,2021,37(7):553-559.

[7]陈苗,马会明,冯亚宏,等.健脾益肾化浊方对多囊卵巢综合征模型大鼠卵巢颗粒细胞凋亡蛋白及PI3K/AKT/mTOR通路的影响[J].中医杂志,2023,64(15):1585-1592.

[14]林倍倍,黄宏丽,夏艳秋,等.朱氏调经方治疗肾虚血瘀型多囊卵巢综合征的临床观察及对性激素,炎性因子的影响[J].中华中医药学刊,2023,41(1):246-250.

文章来源:贺聪,黄亚妮,刘晨晨,等.沉默GATA4对多囊卵巢综合征大鼠模型卵巢颗粒细胞的影响[J].现代肿瘤医学,2024,32(19):3665-3670.