糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是最主要的糖尿病微血管并发症， 是慢性肾脏病和终末期肾脏病(end-stage renal disease, ESRD)的重要原因， 在全球范围内， 与糖尿病患者的死亡率增加有关[1]。 近十年来， 我国经济高速发展， 由于人们饮食结构、 生活方式改变等原因， 国内糖尿病患者数量大幅增加， 所以DN的发病率也明显上升， 糖尿病合并慢性肾脏病患者估计达2 430万[2]。 慢性高血糖和高血压是DN发生发展的主要危险因素， 随着糖尿病患病率的增加， DN的患病率也在不断增加[3]。 DN的发病机制非常复杂， 目前尚不完全清楚， 这也导致治疗效果不佳。 研究表明严格控制血糖和血压的常规治疗方法已不能有效阻止DN的进展和死亡率增加[4]。 研究表明， 氧化应激、 血管紧张素水平过高以及炎症级联反应参与DN的进展， 除却常规疗法， 以炎症反应为靶点的治疗有望阻断DN的进展[5]。

髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell, MDSC)是一群来源于骨髓的异质性细胞， 具有强大的免疫抑制功能， 在肿瘤、 创伤和自身免疫病等疾病状态下能够大量积聚[6]。 有报道显示， MDSC在Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病患者中比例明显增加[7-8]。 研究表明， 过继转移细胞因子诱导的MDSC至DN小鼠模型中能够减轻其肾脏的纤维化程度[9]。 过继转移细胞疗法为DN的治疗提供了新的思路， 然而免疫细胞治疗产生的副作用以及伦理问题仍然存在。

几乎所有的细胞都可以产生外泌体(exosome, EX), 它是细胞内多胞体经质膜融合排出到胞外的囊泡[10]。 EX是胞外囊泡的一种， 直径约100 nm, 内含多种成分， 包括核酸、 蛋白质、 脂质、 氨基酸和细胞代谢产物。 研究表明， MDSC来源的EX具有免疫抑制能力， 在炎症性肠病、 胶原诱导性关节炎小鼠模型中能够起到缓解疾病的作用[11-12]。 相较于细胞免疫治疗， EX具备免疫原性低、 储存运输方便和无伦理学争议等优点。 本研究旨在观察DN模型小鼠中MDSC来源EX(MDSC-derived EX, MDSC-EX)的免疫抑制能力以及对DN模型小鼠的影响， 为DN的治疗提供新思路。

1、材料与方法

1.1 实验动物准备及DN小鼠模型的构建

C57BL/6小鼠， SPF级， 24只， 雄性， 6～8周龄， 体质量(body weight, BW)(23.0±2.0) g, 购自南京医科大学医药实验动物中心。 先给予4 周的高脂饮食饲养， 后按照每只C57BL/6小鼠腹腔注射55 mg/(kg·d)链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)的标准， 连续处理5 d, 构建DN模型。

1.2 主要实验试剂与仪器

MDSC磁珠分选(magnetic-activated cell-sorting, MACS)试剂盒， 购自德国美天旎生物技术有限公司。 RPMI 1640培养液、 FBS, 购自美国GIBCO公司。 ExoQuick-TCTM外泌体提取试剂盒， 购自美国加州SBI公司。抗小鼠CD3、 CD28单克隆抗体和羊抗兔IgG-HRP二抗， 均购自赛默飞世尔科技公司。兔抗小鼠纤维连接蛋白(fibronectin)、 羊抗小鼠Ⅳ型胶原(collagen type Ⅳ, collagen Ⅳ)和兔抗小鼠α平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin, α-SMA)抗体， 均购自艾博抗(上海)贸易有限公司。 兔抗小鼠CD11b-APC、 Ly-6G-FITC以及Ly-6C-PE抗体， 均购自BioLegend公司。培养箱， 来自力康精密科技(上海)有限公司； 流式细胞仪以及流式细胞分选仪器， 均来自美国贝克曼库尔特公司； 大、 小鼠肾小球滤过率(glomerular filtration rate, GFR)实时监测系统， 来自德国MediBeacon公司； 凝胶成像系统， 来自美国通用电气公司。

1.3 MDSC的MACS

摘取DN模型小鼠脾脏， 将其研磨成单细胞悬液后用ACK红细胞裂解液裂解红细胞， 后使用PBS漂洗2次， 先后添加MACS试剂盒羊抗小鼠Ly-6G和Gr-1抗体， 再分别添加磁珠孵育30 min, 混悬液前后2次过磁柱， PBS洗脱， 最后使用PBS将驻留在分选磁柱上的阳选细胞依次冲洗下来并收集， 获得PMN-MDSCs和MO-MDSCs。 随后利用流式细胞术鉴定了分选细胞的纯度， 分别用到了兔抗小鼠CD11b-APC、 Ly-6G-FITC以及Ly-6C-PE抗体。

1.4 MDSC-EX的制备

用超离血清的RPMI 1640培养液培养PMN-MDSCs和MO-MDSCs; 20 h后， 收集细胞培养上清液， 按照ExoQuick-TCTM外泌体提取试剂盒说明， 按1∶5的比例混合提取试剂和细胞培养上清液； 静置16 h后离心收集沉淀物， 即为EX; PBS溶解， -80 ℃条件下保存。

1.5 模型鼠的分组与处理

构建DN小鼠模型， 并且在建模后的第6～13周， 给予每周每只小鼠尾静脉注射100 μg PMN-MDSC-EX或MO-MDSC-EX(每组设置6只小鼠),在第14周处死模型鼠，收集其外周血、尿液和肾脏组织用于后续检测。

1.6 CD3+T细胞增殖能力的检测

用2 μg/mL的抗小鼠CD3抗体包被96孔圆底孔板， 4 ℃静置过夜。 用MACS试剂盒分选健康C57BL/6小鼠脾脏CD3+T细胞， CFSE染料染色后， 按5×105个/孔密度种板； 添加2 μg/mL抗小鼠CD28抗体， 培养3 d后流式细胞术检测CFSE的荧光强度变化。

1.7 模型鼠血糖、 血清学肾功能指标的检测

收集各组小鼠外周血，全自动生化分析仪检测血糖、血清尿素氮(urea nitrogen in serum, UNS)和血清肌酐(creatinine in serum, CS)水平。

1.8 模型鼠GFR的检测

运用MediBeacon大小鼠GFR实时监测系统， 使用发光二极管激发荧光示踪剂， 并通过光电二极管接收发射光， 通过信号的放大和数字化转换， 将数据保存在设备的内存储器中， 通过USB接口保存数据到PC端， 使用软件Preclinical Data Studio分析结果， 即可用于肾脏功能的评价。

1.9 Western blotting检测模型鼠肾脏组织的纤维化程度

肾脏组织研磨均匀，再等体积混合肾组织研磨液与RIPA裂解液， 于冰面上静置1 h, 期间每隔10 min振荡1 min。 12 000×g、 4 ℃离心15 min, 收集上清液。 按体积比4∶1混匀蛋白样本和5×SDS-PAGE, 100 ℃金属浴10 min, 常温14 000×g离心10 min, 备用SDS-PAGE制备的样本。转膜， BSA封闭1 h; 添加一抗(兔抗小鼠fibronectin、 collagen Ⅳ、 α-SMA和β-actin抗体)4 ℃孵育过夜， 第2天用羊抗兔二抗(1∶3 000)室温孵育1 h, 后用发光试剂ECL显色曝光。

1.10 统计学处理

实验数据以

表示，使用t检验比较各组间差异， 检验水准(α)为0.05。

2、结果

2.1 DN小鼠模型的构建

我们给予C57BL/6小鼠4 周的高脂饮食， 并按每只小鼠55 mg/(kg·d)剂量标准腹腔注射STZ, 连续注射5 d, 构建DN小鼠模型。 在构建DN小鼠模型的第6周， 检测模型鼠的空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)浓度。结果显示， DN小鼠的FBG超过23 mmol/L, 显著高于空白对照组(图1A,P<0.01)。 同时DN模型鼠的24 h尿液总蛋白定量(total protein in urine within 24 hours, TPU)、 UNS以及CS也显著升高(图1B～1D, 均P<0.01)。 在DN小鼠建模成功的第14周处死小鼠， 摘取肾脏， 切片并行H-E染色。 显微镜下观察发现DN小鼠模型的肾脏组织中肾小球体积增大， 肾间质和肾小管纤维基底膜增厚， 间质中有淋巴细胞浸润， 伴部分肾小管坏死、 部分上皮细胞嗜酸性染色增强(图1E)。 以上结果表明， 我们成功构建了DN小鼠模型。

图1 DN小鼠模型构建的鉴定

2.2 MDSC的分选

我们通过MACS的方法分选出DN模型小鼠脾脏中PMN-MDSCs和MO-MDSCs, 流式细胞术检测到两者的提取纯度均达90%以上， 满足后续实验要求(图2)。

图2 MDSC的流式细胞术纯度鉴定

2.3 MDSC-EX的制备与鉴定

运用ExoQuick-TCTM试剂盒制备PMN-MDSCs和MO-MDSCs培养上清液中EX, 于透射电子显微镜下分别观察PMN-MDSC-EX和MO-MDSC-EX, 结果显示两者均呈圆形或椭圆形形态(图3A)。 流式粒径检测分析显示， PMN-MDSC-EX和MO-MDSC-EX的直径均在30～110 nm之间(图3B)。 Western blotting结果显示， 相较于PMN-MDSCs和MO-MDSCs, PMN-MDSC-EX和MO-MDSC-EX表达更多的四次跨膜蛋白家族成员CD9和CD63, 以及热休克蛋白HSP70, 不表达钙联蛋白(Calnexin)和GAPDH, 这些结果都符合目前EX的鉴定标准(图3C)。

2.4 MDSC-EX的免疫抑制能力评估

研究表明，MDSC来源的EX具有与亲代细胞相似的免疫抑制能力。 本实验中， 我们对PMN-MDSC和MO-MDSC来源的EX进行了免疫抑制能力的检测。 结果显示， PMN-MDSC-EX和MO-MDSC-EX均对CD3+T细胞的增殖起到抑制作用， 并且PMN-MDSC-EX比MO-MDSC-EX的免疫抑制能力更强(均P<0.05, 图4)。

图3 PMN-MDSC-EX和MO-MDSC-EX的鉴定

图4 不同来源MDSC-EX对CD3+T细胞的增殖抑制作用

2.5 MDSC-EX缓解DN小鼠模型疾病演进

有研究报道，MDSC-EX对于胶原诱导性关节炎、 炎症性肠病以及斑秃等小鼠模型具有抑制炎症的作用[11-12], 因此我们在本研究中关注MDSC-EX对于DN小鼠模型是否也能发挥治疗作用。 实验结果显示， PMN-MDSC-EX和MO-MDSC-EX均可降低DN小鼠的血糖水平， 其中PMN-MDSC-EX的作用更强(图5A, 均P<0.05)。 相较MO-MDSC-EX, PMN-MDSC-EX对小鼠BW的增加作用更显著(图5B,P<0.05)。 与MO-MDSC-EX相比， PMN-MDSC-EX对DN小鼠TPU、 UNS以及CS水平的抑制作用更为显著(图5C～5E, 均P<0.05)。 GFR是反映肾功能和确定肾脏疾病分期的最佳指标。 与正常小鼠相比， DN小鼠的GFR降低， 过继转移MDSC-EX可以升高GFR, 其中PMN-MDSC-EX处理组升高更为显著(图5F, 均P<0.05)。 于建模后第14周处死小鼠， 摘取肾脏， 观察肾脏H-E染色情况。 结果显示， PMN-MDSC-EX和MO-MDSC-EX处理组肾小球体积减小， 肾间质和肾小管纤维基底膜厚度变薄， 炎症细胞浸润减少， 表明PMN-MDSC-EX和MO-MDSC-EX对肾脏组织的损伤具有修复作用(图5G)。 以上结果表明， MDSC-EX可以不同程度地缓解DN, 并且相较于MO-MDSC-EX, PMN-MDSC-EX对于DN模型小鼠的保护作用更为明显。

图5 MDSC-EX缓解DN小鼠模型的疾病演进

2.6 MDSC-EX抑制DN小鼠模型的肾小球硬化

为观察过继转移MDSC-EX对DN小鼠模型肾小球硬化的影响， 我们通过Western blotting检测了肾脏组织中fibronectin、 collagen Ⅳ和α-SMA的表达。 结果表明， MDSC-EX可以显著降低DN模型小鼠肾脏组织中fibronectin、 collagen Ⅳ和α-SMA的水平， 并且相较MO-MDSC-EX, PMN-MDSC-EX对于DN模型小鼠肾小球硬化的缓解作用更显著(均P<0.05)。 详见图6。

图6 MDSC-EX抑制DN小鼠模型的肾小球硬化

3、讨论

DN是目前ESRD最常见的原因， 而肾小球硬化是DN的关键致病机制之一[13]。 肾小球硬化症是由细胞外基质蛋白在系膜间质积聚导致纤维化所致。 系膜细胞是一种独特的基质细胞， 作为肾小球固有细胞中的重要组成， 细胞突起可深至内皮细胞和基底膜之间， 与系膜基质共同构成肾小球系膜。 循环免疫细胞对系膜细胞的影响可能参与了DN中肾小球硬化的发病机制。 最近的研究表明， 由于免疫相关定向因子的表达增加， 参与固有和适应性免疫应答的细胞可以靶向肾脏， 之后趋化而来的免疫细胞激活促炎反应， 释放自分泌和旁分泌因子， 进一步放大炎症反应并损害肾脏； 围绕免疫细胞在DN发病过程中的研究有望为疾病治疗提供新的思路和方法[14]。

MDSC是异质性的未成熟髓系细胞， 在肿瘤、 感染和炎症等情况下能够迅速扩增， 并参与机体的免疫调节[15]。 MDSC可以通过产生精氨酸酶Ⅰ、 诱导型一氧化氮合酶、 活性氧类和抑炎细胞因子发挥免疫抑制功能。 研究表明， DN小鼠模型外周血、 脾脏和肾脏中MDSC比例增加， 而骨髓中MDSC的相对数量减少[9]。 MDSC的异常积聚可能是由炎症性糖尿病状态引起的， 疾病状态促发了未成熟的髓系细胞自骨髓重新分布到外周免疫器官中。 免疫疗法为癌症、 炎症患者以及需要器官移植的患者提供了新的治疗方案， 由于MDSC具有免疫抑制和抗炎活性， 它被广泛用于免疫治疗。 研究表明， 过继转移细胞因子诱导的MDSC可以缓解DN模型小鼠的肾小球硬化[9]。 应用细胞因子诱导的MDSC治疗肾小球硬化和预防DN将成为一种新的治疗方案。 然而， 细胞治疗可能带来的免疫副反应、 存储不便及医学伦理学问题等值得探讨。

EX是细胞分泌的一种膜性囊泡， 研究表明， MDSC来源的EX同样具有较强的免疫抑制能力， 并且已应用于自身免疫性关节炎、 炎症性肠病和自身免疫性斑秃等自身免疫性疾病的治疗[16-18]。 但是， MDSC来源的EX是否对DN有保护作用仍然未知。 鉴于EX应用于治疗的优势， 本研究尝试对DN小鼠模型中MDSC来源EX的免疫抑制能力进行观察， 并且探究MDSC-EX是否能够缓解DN模型小鼠的病情。

首先，我们通过MACS的方法分离出DN模型小鼠脾脏来源MDSCs, 并且自PMN-MDSCs和MO-MDSCs的培养上清液中制备EX。 实验结果表明， PMN-MDSC-EX和MO-MDSC-EX均对CD3+T细胞的增殖起到抑制作用， 并且PMN-MDSC-EX比MO-MDSC-EX的免疫抑制能力更强。 这些结果表明， DN模型小鼠中MDSC来源的EX同样具有免疫抑制能力。

本研究中，我们通过观察小鼠肾脏切片，检测FBG、 BW、 TPU、 UNS、 CS和GFR等指标判断MDSC-EX对病情的影响。 结果显示， 相较MO-MDSC-EX, PMN-MDSC-EX抑制DN模型小鼠肾小球硬化的作用更加明显。 这些结果都表明， MDSC-EX对于DN模型小鼠具有保护作用， 并且PMN-MDSC-EX的效果更加明显。 PMN-MDSC-EX具备更强的免疫抑制能力可能与其内部包裹的精氨酸酶Ⅰ、 miRNA等生物活性成分有关， 但是本研究尚未对PMN-MDSC-EX中的有效成分展开研究， 将作为后续研究的方向[11]。

综上所述，本研究结果表明，MDSC-EX能够缓解DN模型小鼠的病情， 减轻肾小球硬化， 并且PMN-MDSC-EX的效果优于MO-MDSC-EX。 尽管目前针对DN的临床治疗方案主要集中在药物治疗， 但完全依赖药物治疗存在很多副作用， 而EX治疗没有细胞毒性， 也不会对受体细胞产生毒副作用， 具备免疫原性低、 储存运输方便及无伦理学争议等优点， 可以为DN的治疗提供一个新的思路[18]。 今后的研究方向将围绕MDSC-EX的给药方式、 剂量、 有效成分以及分子作用机制展开， 为DN的临床治疗提供新的方法。

文章来源:梁丽,张一珂,邵烁鋆,等.应用髓源性抑制细胞来源外泌体治疗糖尿病肾病小鼠[J].现代免疫学,2024,44(06):474-481.