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健脾化浊方对MAFLD模型小鼠肝组织铁死亡及炎症损伤的影响

2025-03-31 15 上传者：管理员

摘要：目的:探讨健脾化浊方治疗代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)的作用机制｡方法:30只C57BL/6小鼠随机分为正常对照组6只和造模组24只｡造模组采用高脂饲料饮食饲养12周,造模组随机分为MAFLD模型组､中药治疗组､铁死亡抑制剂组､溶媒对照组,每组6只｡予高脂饮食的同时,铁死亡抑制剂组小鼠给予铁死亡抑制剂腹腔注射,溶媒对照组小鼠予生理盐水腹腔注射,中药治疗组小鼠第8周时开始给予健脾化浊方灌胃｡连续干预12周,结束后各组小鼠进行称重,称取肝脏重量,检测外周血肝功能､血脂水平,酶联免疫吸附(Elisa)法检测外周血丙二醛(MDA)及谷胱甘肽(GSH)含量,观察肝脏组织病理改变,实时荧光定量(qPCR)法检测肝组织中炎症因子IL-1β和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达,蛋白质印迹(WB)法检测肝组织ACSL4､GPX4的含量｡结果:与正常对照组比较,模型组小鼠肝脏重量､肝功能､血脂水平明显增高(P<0.05);MAFLD模型组小鼠肝小叶界限不清晰,肝组织结构发生病理性改变,出现大量球形脂滴､炎细胞浸润,肝组织中炎症因子IL-1β和TNF-α明显增高(P<0.05),铁死亡相关指标长链脂酰辅酶A合成酶4(ACSL4)､MDA含量明显升高(P<0.05),而谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)､GSH含量明显降低(P<0.05)｡与MAFLD模型组比较,中药治疗组小鼠肝脏重量､血脂水平降低(P<0.05),肝组织病理有所恢复,肝组织炎症减轻,ACSL4､MDA含量减少(P<0.05),GPX4､GSH含量增加(P<0.05)｡结论:健脾化浊方可改善MAFLD模型小鼠肝组织铁死亡及炎症损伤,发挥治疗MAFLD的作用｡

关键词：
代谢相关脂肪性肝病
健脾化浊方
慢性肝病
肝细胞脂质过度堆积
铁死亡
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代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)是一个新的疾病定义,用于取代之前的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)｡MAFLD是肝细胞脂质过度堆积为特征的慢性肝病,全球总患病率为32. 4%[1],已成为全世界最常见的慢性肝病[2]｡MAFLD正以前所未有的趋势席卷而来,已构成一个重大的公共卫生问题｡MAFLD进一步发展不仅会导致肝硬化､肝衰竭､肝细胞癌[3],而且常合并多种代谢紊乱,引起2型糖尿病､高脂血症､肥胖症等代谢性疾病的发生,已成为人类健康的一大威胁,严重威胁着人类健康｡因此,应积极寻找和研发有效治疗MAFLD的药物,这对于减少或逆转MAFLD的发生和发展具有巨大的临床价值｡目前针对MAFLD的治疗主要还是以控制饮食､运动疗法､减肥等措施为主,临床收效甚微｡中医药治疗MAFLD具有一定的优势,从脾胃论治乃中医临床肝病经典治疗方法｡健脾化浊方是全国名中医乐德行治疗MAFLD的经验方,临床疗效显著,但作用机制不详｡本研究将通过观察健脾化浊方对MAFLD小鼠肝组织铁死亡及炎症损伤的影响,进一步探讨健脾化浊方治疗MAFLD的作用机制｡

1、材料与方法

1. 1动物及饲养

C57BL/ 6雄性小鼠,清洁Ⅱ级,体重23. 5 ~27. 5 g,于新疆医科大学医学实验动物中心饲养｡饲养条件:SPF级,室温(24 ± 2)℃,空气湿度50%左右,12 h光照/黑暗循环,每笼5 ~ 6只,自由进食和饮水｡

1. 2主要药物和试剂

健脾化浊方由麸炒白术､茯苓各20 g,麸炒枳实､厚朴､人参､神曲各10 g,黄连､荷叶各6 g,姜半夏､干姜各9 g等药物组成,购自新疆医科大学附属中医医院药剂室｡高脂饲料购自江苏协同医药生物工程有限责任公司｡酶联免疫吸附( Elisa)试剂盒购自上海酶联生物｡抗体购自abcam公司(长链脂酰辅酶A合成酶4 (ACSL4):ab205199,abcam;谷胱甘肽过氧化酶4 (GPX4):ab255789, abcm;甘油醛⁃3⁃磷酸脱氢酶:ab8245, abcam)｡

1. 3实验方法

小鼠适应性饲养1周后,随机分为5组:正常对照组小鼠以普通饲料饲养,MAFLD模型组小鼠以高脂饲料饲养,中药治疗组小鼠以高脂饲料饲养并从第8周起给予健脾化浊方(24. 6 g / kg)灌胃,溶媒对照组小鼠每日给予生理盐水腹腔注射并使用高脂饲料饲养,铁死亡抑制剂组小鼠每日给予铁螯合剂(DFO,100 mg / kg,Sigma)腹腔注射并使用高脂饲料饲养｡每周进行1次体重称量,并观察小鼠精神状态､活动度等,12周后使用戊巴比妥钠对各组小鼠行安乐死｡

1. 4检测指标及方法

1. 4. 1血液学指标

禁食不禁水12 h后进行眼眶取血,立即3 000 rpm离心10 min分离血清保存于- 20℃冰箱备用｡采用全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)､天门冬氨酸氨基转移酶(AST)､三酰甘油(TG)､胆固醇(TC)水平｡采用ELISA试剂盒检测丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)水平,酶标仪读取450 nm波长各孔吸光度,并根据标准曲线计算相应样品的浓度｡

1. 4. 2肝湿重和肝脏指数

取血后开腹,分离肝脏并称重,计算肝脏指数(肝重/处死时体重× 100% )｡

1. 4. 3肝组织病理学观察

肝脏组织经4%多聚甲醛溶液固定,酒精梯度脱水,二甲苯组织透明后常规石蜡包埋,切片机对蜡块进行5 μm切片,烤片后进行HE染色并在显微镜下观察､拍照｡

1. 4. 4肝组织中炎症因子表达

取冻存的肝脏组织50 mg,加入1 ml Trizol充分研磨匀浆,加入0. 2 ml氯仿抽提,12 000 rpm离心10 min后取上层RNA加入无水乙醇,转移吸附柱再次离心并漂洗,加入50 μl RNase free水溶解RNA｡使用逆转录试剂盒合成cDNA,并构建PCR反应体系:ddH2O7 μl,SybrGreen qPCR Master Mix 10 μl,正､反向引物各0. 5 μl,cDNA 2μl,扩增条件为:94℃10 min,(94℃20 s, 55℃20 s,72℃20 s ) 40个循环｡引物序列为: IL⁃1β forward 5′⁃TGGCAACTGTTCCTG⁃3′, reverse 5′⁃GGAAGCAGCCCTTCATC⁃TTT⁃3′; TNF⁃α forward 5′⁃AGCCAGGAGGGAGAACAGA⁃3′,reverse 5′⁃CAGTGAGTGAAAGGGACAGAAC⁃3′｡利用2- ΔΔCT法分析目的基因的表达水平｡

1. 4. 5肝组织中铁死亡相关标志物蛋白含量

取冻存肝组织加入RIPA裂解液,离心后取上清蛋白进行BCA蛋白定量｡蛋白中加入5 ×上样缓冲液混合均匀沸水浴5 min使蛋白变性,制备聚丙烯酰胺凝胶,蛋白离心后上样｡按照浓缩胶恒定电压80 V,30 min;分离胶恒定电压120 V,60 min进行电泳,转膜后切胶｡5%脱脂奶粉封闭后,与一抗在4℃ 下孵育过夜｡用PBST洗涤后,与辣根过氧化物酶(HRP)偶联二抗在室温下孵育1 h,利用化学发光仪拍照｡

1. 5统计学方法

采用SPSS 20. 0软件进行数据分析｡计数资料数据呈正态分布,以均数±标准差( x± s)表示｡两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析｡P < 0. 05表示差异有统计学意义｡

2、结果

2. 1各组小鼠体重和肝指数比较

MAFLD小鼠的肝湿重以及肝指数显著高于正常对照组小鼠(P < 0. 05),而中药治疗组小鼠的肝湿重和肝指数均显著低于MAFLD模型组小鼠(P <0. 05)｡见表1｡

表1各组小鼠肝湿重和肝指数比较

2. 2各组小鼠血清肝功能及血脂

MAFLD模型组小鼠血清中ALT､AST､TG､TC均显著高于正常对照组小鼠(P < 0. 05),中药治疗组小鼠血清中ALT､AST､TG､TC的含量均显著低于MAFLD模型组小鼠(P < 0. 05)｡见表2｡表2各组小鼠血清ALT､AST､TG､TC水平比较

2. 3肝脏组织病理形态

HE染色显示,正常对照组小鼠肝组织结构正常,周围细胞索呈放射状排列,无脂肪变性细胞,细胞质均匀｡MAFLD模型组小鼠肝小叶界限不清晰,肝组织结构发生病理性改变,出现大量球形脂滴,炎症细胞浸润｡与MAFLD模型组比较,中药治疗组小鼠肝组织病理形态得到一定程度改善,球形脂滴及炎症细胞浸润减少｡同时,溶媒对照组小鼠肝脏病理与高脂饲料喂养的比较类似,存在结构改变､球形油脂以及炎症细胞浸润等｡铁死亡抑制剂组肝组织病理改善,炎症浸润减少｡见图1｡

图1各组小鼠肝脏组织病理形态(HE,200 × )

2. 4各组小鼠肝组织中炎症因子

IL⁃1β和TNF⁃α的mRNA表达量比较MAFLD模型组小鼠肝组织IL⁃1β和TNF⁃α的mRNA表达均显著高于正常对照组小鼠(P < 0. 05),中药治疗组显著降低了IL⁃1β和TNF⁃α的mRNA表达量(P < 0. 05)｡同时,铁死亡抑制剂组小鼠肝组织IL⁃1β和TNF⁃α的mRNA表达量均显著低于溶媒对照组小鼠(P < 0. 05)｡见图2｡

图2各组小鼠肝组织中炎症因子IL⁃1β和TNF⁃α的mRNA表达量比较

2. 5各组小鼠肝组织中铁死亡相关标记蛋白的含量比较

MAFLD模型小鼠肝组织中铁死亡相关标记蛋白ACSL4含量明显高于正常对照组小鼠,而GPX4含量明显低于正常对照组小鼠｡中药治疗组小鼠肝脏ACSL4含量明显低于MAFLD模型组,而GPX4含量明显高于MAFLD模型组小鼠｡见图3｡

图3蛋白印记实验检测小鼠肝组织中铁死亡相关蛋白ACSL4和GPX4的表达水平

2. 6各组小鼠血清中铁死亡相关GSH和MDA的含量比较

MAFLD模型组小鼠血清中GSH含量显著低于正常对照组小鼠(P < 0. 05),中药治疗组小鼠相比MAFLD模型组小鼠GSH含量显著升高(P < 0. 05),铁死亡抑制剂组相比溶媒对照组小鼠GSH含量显著升高(P < 0. 05);同时,MAFLD模型组小鼠血清中MDA含量显著高于正常对照组小鼠(P < 0. 05),中药治疗组小鼠相比MAFLD模型组MDA含量显著降低(P <0. 05),铁死亡抑制剂组小鼠相比溶媒对照组小鼠MDA含量显著降低(P < 0. 05)｡见图4｡

图4 ELISA试剂盒检测小鼠血清中GSH和MDA的含量(∗P < 0. 05)

3、讨论

目前MAFLD的治疗不尽如人意,已经成为困扰肝病学界的瓶颈问题[5]｡中医学没有MAFLD的病名,根据其症候表现多归属于中医学的“痰浊” “胁痛” “肝浊” “痞满” “肥气”“胀满”等范畴[6],中医药可能是治疗该病有前途的方法,从脾胃论治乃中医临床肝病经典治疗方法,临床疗效显著,但具体机制不详｡健脾化浊方是乐老治疗MAFLD的经验方,由麸炒白术､人参､茯苓､麸炒枳实､厚朴､姜半夏､黄连､干姜､神曲等组成,本方是由李东垣《兰室秘藏》枳实消痞丸化裁而来,具有健脾益气升清,行气和胃降浊之功｡方中人参､茯苓､白术､炙甘草(四君子汤)益气健脾,枳实､厚朴行气消痞除满,黄连苦寒清热燥湿而除痞,半夏辛温散结而和胃,少佐干姜辛热温中祛寒,三药相伍,辛开苦降,调畅气机｡全方健脾益气升清､行气和胃降浊,使脾胃之升降､出入､纳化､燥湿达到平衡,用于因脾虚运化失常所致寒热互结,升降失职,气滞湿聚所致疾病｡对于MAFLD临床疗效显著,但具体作用机制不详｡

MAFLD是以肝细胞内脂质的异常储存和炎症反应为主要特征的临床病理综合征｡已知肝细胞内脂肪滴的异常积累､氧化应激导致的炎症反应,肝细胞死亡以及引发的肝纤维化可驱动MAFLD的进展｡随着MAFLD的研究进展,也逐渐发现在MAFLD中存在不同类型死亡的细胞共存[7]｡其中铁死亡作为一种新的细胞死亡形式,其特征是铁过载和活性氧(ROS)依赖的脂质过氧化物积累,导致不可控的氧化还原反应和最终的细胞死亡｡在MAFLD中,肝脏铁死亡是引发炎症的重要因素[8]｡有报道称在肝脏高铁摄入引起的血色沉着病涉及铁死亡的发生,这对于肝细胞癌的索拉菲尼治疗是有帮助的[9]｡然而,铁过载在MAFLD中却被认为是其发病的独立危险因素,铁螯合剂可以预防实验性脂肪肝模型中的代谢综合征和脂肪性肝炎[10]｡目前,大量研究已证实铁死亡参与了MAFLD的发病机制并发挥重要功能,使用铁死亡诱导剂处理的蛋氨酸/胆碱缺乏的饮食喂养小鼠会加剧其肝脏脂肪变性,炎症浸润和血清生化水平[11]｡本研究中健脾化浊方可改善MAFLD血清生化指标,减轻MAFLD肝组织中促炎因子IL⁃6､TNF⁃α和IL⁃1β的表达,减轻肝脏脂肪变｡

铁死亡作为一种新型的程序性细胞死亡,其涉及多种信号通路,GSH是铁死亡最经典的调节通路,GSH由谷氨酸､半胱氨酸和甘氨酸共同合成,可被氧化脱氢为氧化型谷胱甘肽｡GPX4通过调节细胞的抗氧化反应清除机体内自由基,从而保护细胞抑制铁死亡｡尽管精准的信号调节机制尚未完全阐明,但是已证明铁死亡是由GPX4以及ACSL4等分子共同调节的[11,12]｡其中GPX4被认为是对抗铁死亡的最重要的“守护者”,GPX4失活是诱导铁死亡的主要原因｡GPX4通过调节细胞的抗氧化反应清除机体内自由基,从而保护细胞抑制铁死亡｡因此,GSH减少时GPX4的功能受到抑制,细胞内脂质过氧化物,如MDA累积,使得整个细胞膜的脆性增加,造成细胞功能减退,最终触发细胞铁死亡｡本课题证实健脾化浊方可以增加GSH,上调MAFLD小鼠肝脏中GPX4的表达,降低ACSL4的表达,较少脂质过氧化物MDA的生成,同时抑制炎症因子的分泌,提示GSH调节的肝脏铁死亡与健脾化浊方的治疗作用相关｡

综上,健脾化浊方可通过影响MAFLD小鼠肝组织铁死亡,从而减轻MAFLD小鼠肝组织炎症损伤和脂肪变,为其临床推广应用提供新的理论依据｡在未来的研究工作中,将进一步探究健脾化浊方是如何调控不同细胞类型的铁死亡来改善MAFLD,对充实和完善从脾胃论治MAFLD具有重要的理论价值及临床指导意义｡

参考文献:

[4]余思邈,李萍,李园,等.从“见肝之病,知肝传脾,当先实脾”探讨肝硬化的防治[ J].北京中医药大学学报,2022,45 ( 1 ):29 - 33.

[5]肖卫纯,安威.线粒体损伤在非酒精性脂肪性肝病发生发展中的作用[J].临床肝胆病杂志,2021,37(7):1515 - 1521.

[6]徐亮,宓余强,李萍.非酒精性脂肪肝中医证型客观化研究[ J].中华中医药杂志,2015,30(7): 2544 - 2547.

基金资助:新疆维吾尔自治区卫生健康青年医学科技人才专项科研项目(No.WJWY-202432);新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(No.2022D01C155);乐德行全国名中医工作室(国中医药办人教函[2022]245号);

文章来源:张荣,刘云霄,牛丽娜,等.健脾化浊方对MAFLD模型小鼠肝组织铁死亡及炎症损伤的影响[J].中西医结合肝病杂志,2025,35(03):340-344.