阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)是一种与衰老[1]和脂质代谢紊乱[2]密切相关的中枢神经系统退行性疾病。该病的主要特征包括进行性认知功能障碍和行为损害[3]。近期研究显示，脂质代谢紊乱普遍存在于AD患者的早期阶段[2]。AD属于中医“痴呆”范畴，其病机为肾阳不足、肾精亏虚、髓海不足[4]。因此，临床常用补肾阳、益肾精的药物治疗[5]。中药锁阳性温味甘，具有补肾阳、益肾精的作用。本课题组前期研究发现，锁阳乙酸乙酯提取物(the ethyl acetate extract of cynomorium songaricum, ECS)具有显著的抗衰老和抗氧化作用[6],但对其调节脂质代谢的研究较少。

秀丽隐杆线虫(以下简称线虫)基因与人类基因组具有高度同源性，且神经系统研究基础完备[7]。在线虫短暂的生命周期(2～3周)中呈现出显著的衰老特征，因此成为研究机体衰老机制的理想模式生物，相关转基因线虫已被广泛应用于AD候选药物的药理研究中。本研究选取野生型线虫N2及公认AD模型Aβ转基因株CL4176作为模式生物[8],探索ECS对AD模型线虫的影响，包括抗衰老、抗氧化应激及调节脂质代谢，以期为“从肾治脑”中医理论提供基础依据。

1、材料

1.1线虫

尿嘧啶缺陷型大肠杆菌(E.coli OP50,简称OP50)、野生型秀丽隐杆线虫(N2)虫株均由北京中医药大学刘永刚老师课题组惠赠。秀丽隐杆线虫突变株CL4176由北京中医药大学谭鹏老师课题组惠赠。

1.2药物与试剂

锁阳饮片(北京同仁堂饮片有限公司);琼脂粉、蛋白胨、酵母提取物、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸镁、氯化钙、胆固醇、氢氧化钠、左旋咪唑(北京拜尔迪生物技术有限公司);石油醚、乙酸乙酯、无水乙醇(北京虹湖联合化工有限公司);总RNA提取试剂盒(Solarbio,货号：R1200);cDNA反转试剂盒(ThermoFisher Scientific,货号：K1622);qPCR Master Mix(Vazyme,货号：Q712);油红O粉末(Solarbio,货号：O8010);活性氧(reactive oxygen species, ROS)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号：E004-1-1)。

1.3仪器

iMark酶标仪[伯乐生命医学产品(上海)有限公司];高速低温台式冷冻离心机(德国Eppendorf,型号：Centrifuge5424R);倒置荧光显微镜(尼康);PCR仪(Bio-rad公司，型号：S1000);超净工作台(苏州净化设备有限公司，型号：WCJ2FD);生化培养箱(上海博讯实业有限公司，型号：SPX100BZ);体式显微镜(德国徕卡，型号：Leica EZ4W)。

2、方法

2.1 ECS提取

称量锁阳饮片1 kg,打粉，60目过筛得到锁阳粉末。称取适量锁阳粉末，加入10倍量70%乙醇浸泡过夜。次日过滤收集上清液，加入新的70%乙醇，反复超声提取3次，收集上层溶剂，减压抽滤，旋转蒸发仪加热、回流、浓缩至无醇味。石油醚与浓缩液(2：1)萃取4～5次，弃去石油醚层。再用乙酸乙酯(乙酸乙酯：浓缩液=2：1)萃取4～5次直至萃取液变清澈。收集有机层，合并有机层。将萃取液用旋转蒸发仪进行减压浓缩，制备冻干粉，刮下称重，保存在干燥的玻璃小药瓶中。最终得到黄棕色粉末，测定ECS的提取率为2.36%,杂质含量<2%,总灰分<12%,符合《中华人民共和国药典》标准。

2.2线虫生长培养基(nematode growth medium, NGM)及OP50菌液制备

NGM:取氯化钠3 g,胰蛋白胨2.5 g,琼脂17 g及胆固醇5 mg,溶于盛有1 mL无水乙醇的离心管中，涡轮使其充分溶解，加入基础液定容至1 L。

LB液体培养基(200 mL):取蛋白胨2 g,氯化钠2 g,酵母粉1 g,用去离子水定容至200 mL,121℃ 高压灭菌30 min后使用。

采用灼烧灭菌的金属环挑取OP50菌落，接种于200 mL LB液体培养基中，放入37℃恒温培养箱中培养12 h后，密封保存在4℃冰箱中备用。在超净台中，将200μL OP50菌液接种于NGM。待菌液晾干形成菌膜，室温放置12 h后即可使用。

2.3线虫同步化处理

通过限时产卵法进行线虫同步化处理。使用Picker挑取50～100条处于产卵期的秀丽隐杆线虫，将其转移至新铺的OP50的培养基中，产卵3 h后，将产卵期成虫全部挑走，从而实现线虫同步化。

2.4线虫分组及给药

将产卵板放置于相应品系且温度适宜的生化培养箱中，待幼虫生长至L4期。将同步化的L4期野生型线虫作为空白组(N2组),L4期AD突变体线虫CL4176随机分为模型组(CL4176组)和ECS组(CL4176+ECS组)。三组均在滴加200μL大肠杆菌OP50的NGM板上培养，其中N2组于20℃恒温培养箱，其余2组于16℃ 恒温培养箱，给药3 d。

参照本课题组前期研究，ECS在线虫的最佳给药浓度为0.4 g·L-1[9]。具体给药方法为：取0.1 g ECS冻干粉溶于100μL DMSO,配成质量浓度为1 000 g·L-1的母液。将ECS母液与E.coli OP50混合，制成0.4 g·L-1的菌液，取200μL滴加到NGM进行给药。

2.5寿命实验

每组挑取30条同步化处理的线虫，每天将线虫转至新培养皿中以确保药物在整个实验过程中不失效，并使用铂金丝轻轻刺激，记录存活线虫的数量，直至全部线虫死亡。

2.6慢性百草枯应激实验

每组取30条同步化处理的线虫，转移到含4 mmol·L-1百草枯的NGM上，每天检查线虫的生存情况并计数，直至全部线虫死亡。

2.7急性热应激实验

在35℃条件下进行急性热应激实验，每板30条同步化处理的线虫，每隔2 h统计线虫的存活、死亡、剔除数目，直至培养基上的线虫全部死亡。秀丽隐杆线虫死亡的标准为：多次用Picker触碰虫体及头部未见反应。秀丽隐杆线虫剔除的标准为：活动到培养皿壁上的个体不纳入统计。

2.8头摆实验和正弦运动实验

头摆实验：每组选取12条同步化处理的线虫，用Picker挑入未添加E.coli OP50的NGM上，经过30 s恢复后，加入1滴M9缓冲液，记录线虫30 s内的头部摆动次数(线虫头部相对于身体长轴方向摆到一侧记为1次)。

正弦运动实验：方法同上，记录线虫30 s内的正弦运动次数(线虫相对于身体长轴一个波长的移动记作1次身体弯曲)。

2.9体宽体长实验

每组取10条同步化处理的线虫，在显微镜下观察并拍照，采用Image J软件测定各组线虫的体长与体宽。

相对体宽(%)=模型组或ECS组体宽/空白组体宽×100%

相对体长(%)=模型组或ECS组体长/空白组体长×100%

2.10 ROS水平检测

采用荧光分子探针(H2DCF-DA)测定秀丽隐杆线虫的ROS水平。每组取30条线虫，将其与100μmol·L-1H2DCF-DA孵育30 min,使用5 mmol·L-1左旋咪唑进行麻醉。麻醉后的线虫用M9缓冲液洗涤，随后放置在约1 mm厚的2%琼脂糖上。通过荧光显微镜观察ROS的表达水平，Image J软件分析荧光强度。

2.11油红O实验检测脂肪含量

使用含2%Triton X-100的异丙醇溶解油红O粉末，制备油红O溶液。收集3组线虫，用M9缓冲液洗涤。1%多聚甲醛固定线虫20 min后，将其浸泡于油红O溶液染色2 h,再次使用M9缓冲液洗涤。将线虫转移到铺有琼脂糖垫片的载玻片上，在显微镜下观察油红O染色情况并拍照，每组12条线虫。

2.12游离脂肪酸(non-esterified fatty acids, NEFA)含量检测

收集各组线虫，用M9缓冲液清洗。根据NEFA测定试剂盒说明书的步骤，检测各组线虫体内NEFA含量。

2.13 qRT-PCR法检测nhr-49、acs-2、sodh-1、fat-7基因表达水平

收集3组线虫，使用M9缓冲液清洗。根据RNA提取试剂盒的说明书提取总RNA,按照RT试剂盒说明书进行逆转录操作。荧光定量PCR反应总体系20μL,反应结束后使用2-ΔΔCT法计算目的基因的相对表达水平。以β-actin为内参基因，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1引物序列

2.14统计学方法

实验数据采用SPSS 26.0和GraphPad Prism10软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差表示。符合正态分布且方差齐的数据，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，不符合正态分布的数据采用非参数秩和检验。生存曲线实验结果采用Kaplan-Meier检验进行分析。P<0.05为差异具有统计学意义，每个测定至少独立重复3次。

3、结果

3.1 ECS可延长秀丽隐杆线虫的寿命

寿命指标为评价线虫衰老的重要指标之一[10]。寿命实验显示，与N2组比较，CL4176组线虫的平均寿命缩短；与CL4176组比较，CL4176+ECS组线虫的平均寿命延长(P<0.01),见图1A、表2。

表2各组线虫的寿命实验结果

线虫在各种应激源刺激下的存活率与其寿命呈正相关。因此，采用慢性百草枯应激实验与急性热应激实验，进一步证实ECS的抗衰老作用。结果显示，与N2组比较，CL4176组线虫的平均寿命缩短；与CL4176组比较，CL4176+ECS组线虫的平均寿命延长(P<0.01),见图1B、图1C、表3、表4。

表3各组线虫的慢性百草枯应激实验结果

表4各组线虫的急性热应激实验结果

图1生存曲线图

3.2 ECS可提高秀丽隐杆线虫的运动能力

线虫的头部摆动与正弦运动频率是评价其运动能力的重要指标，也可用于评价其衰老进程[11]和神经系统功能。结果显示，与N2组比较，CL4176组线虫的头摆频率、正弦运动频率降低(P<0.01)。与CL4176组比较，CL4176+ECS组线虫的头摆频率、正弦运动频率升高(P<0.01),见图2。

图2各组线虫的头部摆动与正弦运动频率比较

3.3 ECS可降低线虫的体宽与体长

与N2组比较，CL4176组线虫的平均/相对体宽、平均/相对体长增加(P<0.001)。与CL4176组比较，CL4176+ECS组线虫的平均/相对体宽、平均/相对体长减少(P<0.001),见表5、图3。本课题组前期转录组学结果表明，ECS的作用机制与脂质代谢信号通路高度相关[14]。因此，推测ECS可能通过调节脂肪含量，从而影响AD线虫的体型。

图3各组线虫的相对体宽与相对体长比较

表5各组线虫的体宽、体长比较

3.4 ECS可降低线虫ROS水平

许多神经退行性疾病与氧化应激有关，氧化应激也是导致衰老的主要原因之一[12]。在线虫衰老过程中，其体内不断产生具有强氧化能力的ROS,因此ROS被认为是引起衰老的主要原因之一[13]。结果显示，与N2组比较，CL4176组线虫体内ROS水平升高；与CL4176组比较，CL4176+ECS组线虫体内ROS水平降低(P<0.05),见图4。

图4各组线虫体内ROS水平比较

3.5 ECS可降低线虫脂肪与NEFA含量

油红O染色用于检测秀丽隐杆线虫体内脂肪含量[15]。结果显示，与N2组比较，CL4176组线虫脂肪与NEFA含量升高；与CL4176组比较，CL4176+ECS组线虫脂肪与NEFA含量降低(P<0.05),见图5、图6。

图5各组线虫油红O染色图

图6各组线虫脂肪与NEFA含量比较

3.6 ECS调节秀丽隐杆线虫脂质代谢的机制

qRT-PCR显示，与N2组比较，CL4176组线虫的fat-7mRNA、acs-2mRNA、sodh-1mRNA水平升高，nhr-49mRNA水平降低(P<0.01)。与CL4176组比较，CL4176+ECS组线虫的acs-2mRNA、sodh-1mRNA水平降低，nhr-49mRNA水平升高(P<0.01),见图7。

图7各组线虫nhr-49、acs-2、sodh-1、fat-7基因表达水平比较

4、讨论

锁阳又称锈铁棒、锁严子，《本草纲目》记载其“甘、温、无毒，益精血”。锁阳通常寄生于蒺藜科白刺属植物根部，为锁阳科植物锁阳的干燥肉质茎。AD在中医学属“痴呆”范畴，《医林改错》云：“灵机记性不在心，在脑。”明确提出痴呆病位在脑。肾精亏虚，不能上充于脑，导致脑髓渐空，则表现为记忆力衰退等AD症状，正如《灵枢·海论》言：“髓海不足，则脑转耳鸣，胫酸眩冒，目无所见，懈怠安卧。”因此，临床多采用补肾阳、益肾精药物如锁阳治疗痴呆。现代研究表明，锁阳具有神经保护、抗衰老及调节免疫等作用[16]。课题组前期研究发现，ECS可提高AD模型动物的学习与记忆能力[17],并在线虫模型中显示出显著的抗衰老作用[15]。

现代研究证实，AD患者的认知功能障碍与衰老、氧化应激及脂质代谢紊乱密切相关[18]。其中，脂质代谢紊乱可导致自由基产生增加，从而引发氧化应激反应。氧化应激可损伤神经元的细胞膜结构、蛋白质和核酸，进而导致神经元死亡和功能障碍[19]。秀丽隐杆线虫基因与人类高度同源、生命周期短且成本低廉，已成为衰老及其相关退行性疾病研究中广泛应用的模式生物[20-21]。根据“淀粉样蛋白级联”假说，Aβ毒性参与AD的发病机制。通常，Aβ毒性会导致线虫行为障碍和寿命缩短[22]。实验研究发现，ECS可显著提高线虫寿命，提高其抗逆能力，并清除体内ROS,减轻由Aβ介导的行为障碍，展现出显著的抗衰老效果。本研究发现，ECS能够调节线虫体型。基于课题组前期的转录组学研究结果推测，ECS改善AD模型线虫行为学表型的作用机制可能与调节脂质代谢有关。

前期转录组学分析表明，ECS改善AD线虫认知功能的作用与过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor, PPAR)通路高度相关。nhr-49基因在线虫中的生物学功能如代谢、脂肪储存和寿命调控方面，与哺乳动物PPAR高度相似[23],并在包括脂肪酸β氧化[24]等多种代谢途径中发挥积极作用。fat-7可调节脂质生物合成，是呼吸活动和氧气消耗所必需的基因[25]。本研究显示，ECS可能通过下调线虫fat-7基因表达，在一定程度上减少线虫体内的脂质合成，并通过上调nhr-49基因表达从而促进脂质分解。acs-2作为nhr-49的下游基因[26-28],是一种酰基辅酶A合成酶，可催化脂肪酸转化为酰基辅酶A,从而进行脂肪酸的β氧化。本研究中，ECS下调acs-2基因表达水平，可能由于脂肪含量降低，减弱了转录反应，降低了acs-2表达水平，限制了进一步的能量消耗，从而对线虫起到保护作用，该结果与文献报道一致[27-28]。此外，ECS可降低山梨糖醇脱氢酶sodh-1的表达。sodh-1是人类酒精脱氢酶的同源物，可将山梨糖醇代谢为果糖，进而转化为糖原，sodh-1表达的减少可降低糖原储存[29]。已有研究表明，在依赖葡萄糖作为主要能量来源的组织中，糖原储存的改变会影响脂质代谢[30]。因此，sodh-1表达降低可能通过减少糖原含量进一步影响线虫体内的脂质代谢。

综上所述，ECS通过降低AD模型线虫体内ROS水平以增强其抗氧化能力，并通过调节脂质代谢来改善脂质过度累积，从而发挥延缓衰老、改善认知功能的作用。本研究为AD的临床治疗提供新思路，并为锁阳治疗AD提供依据。后续将在哺乳动物模型中深入研究，以进一步明确锁阳和ECS的药理机制。

参考文献:

[4]陈民.老年痴呆肾虚痰瘀病机浅析[J].中医药学刊,2006,24(10):1807-1808.

[5]伍媛,黄晓丹,吴林,等.从阳虚论治老年性痴呆的研究进展[J].广西医学,2019,41(8):1009-1011,1039.

[6]苏磊,胡梦圆,李玲玲,等.根皮苷对秀丽隐杆线虫寿命的影响[J].现代中西医结合杂志,2022,31(10):1364-1368.

[10]宋祯彦,黄亚琦,王也彤,等.茯苓多糖在秀丽隐杆线虫中的抗氧化和抗衰老作用及其作用机制[J].中草药,2024,55(4):1133-1144.

[11]苗祥贞.基于秀丽隐杆线虫模型探讨骆驼蓬子不同炮制品毒效作用及机制研究[D].北京:北京中医药大学,2019.

[14]胡梦圆,苏磊,张昕雨,等.基于转录组测序探讨锁阳提取物对线虫衰老的影响[J].现代中西医结合杂志,2022,31(18):2488-2495.

[15]MAK H Y,NELSON L S,BASSON M,et al.Polygenic control of Caenorhabditis elegans fat storage[J].Nat Genet,2006,38(3):363-368.

[16]程丹,郑俊超,马素亚,等.锁阳化学成分及其药理毒理作用研究进展[J].中医药导报,2018,24(5):108-110,113.

[17]郑俊超,马素亚,于雪,等.锁阳乙酸乙酯提取物的雌激素样作用研究[J].天然产物研究与开发,2016,28(11):1687-1690.

基金资助:国家中医药管理局高水平中医药重点学科建设项目(zyyzdxk-2023256);

文章来源:张煦雅,符琰,李雪,等.锁阳乙酸乙酯提取物对AD模型秀丽隐杆线虫脂质代谢的影响[J].中医学报,2024,39(12):2640-2647.