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探讨在糖尿病大鼠视网膜神经节细胞中RU486的保护作用及机制

2020-06-02 250 上传者：管理员

摘要：目的:探讨RU486对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞(RGC)的保护作用及机制。方法:雄性SD大鼠40只,采用随机数字表法分成对照组(CON)、糖尿病组(DM)、RU486治疗组及RU486+DAPT(Notch1信号通路抑制剂)组。后三组大鼠采用单次腹腔注射链脲佐菌素(STZ,50mg/kg)诱导糖尿病模型。模型诱导成功后,RU486组及RU486+DAPT组大鼠腹腔注射RU486[20mg/(kg•d)],RU486+DAPT组给予DAPT5μl(10μmol/L)玻璃体内注射给药。12周后,试剂盒检测大鼠血清糖皮质激素(GC)浓度,免疫荧光染色检测视网膜Notch1表达,Western印迹检测Notch1、Hes-1、GAP-43相对表达量,HE染色检测RGC密度。结果:与CON组相比,DM组及RU486+DAPT组GC浓度、GAP-43表达明显增加,Notch1、Hes-1表达、RGC密度明显降低(均P<0.05);而与DM组相比,RU486组RGC密度、Notch1、Hes-1及GAP-43表达均明显增加(均P<0.05),而DM组与RU486+DAPT组之间比较无统计学差异(P>0.05)。结论:RU486对糖尿病状态下RGC损伤具有神经保护作用,其机制与激活Notch1/Hes-1信号通路有关。

关键词：
Notch1/Hes-1信号通路
RU486
大鼠
生长相关蛋白-43
糖尿病视网膜病变
糖皮质激素
视网膜神经节细胞
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体内糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)含量增加为糖尿病的重要表现之一[1]。有学者报道,小剂量GC治疗糖尿病视网膜病变(Diabeticretinopathy,DR)具有明显的疗效,但过量或延长使用疗程会引起眼内并发症[2]。本研究前期研究发现,应用RU486对抗体内过多的GC可改善DR状态下视网膜神经节细胞(Retinalganglioncell,RGC)损伤[3],但具体机制不清。Notch1与神经元受损后修复密切相关,与Mash-1基因、Hes-1基因联系密切[4]。因此,本研究在应用RU486的情况下加用Notch1通路抑制剂,进而探讨RU486治疗DR的具体机制。

1、材料与方法

1实验动物与试剂仪器

雄性SD大鼠40只,体质量220～250g(购自锦州医科大学,0000455)。链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ,Sigma);大鼠内源性GC试剂盒(上海信帆公司);HE染色试剂盒(碧云天公司);Notch1、Hes-1、GAP-43抗体(Abcam公司);免疫荧光、Western印迹二抗(PTG公司)。荧光倒置显微镜(日本Olympus公司);冰冻切片机(德国SLEE公司);水平电泳仪(美国BIO-RAD公司)。

2、研究方法

2.1动物分组及模型制备:

大鼠随机分成对照组(CON)、糖尿病组(DM)、RU486治疗组(RU486)及RU486+DAPT组四组,每组10只。后三组大鼠按50mg/kg腹腔注射STZ,72h后测血糖,将血糖浓度大于16.7mmol/L的大鼠定为糖尿病模型。以二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)溶解RU486,参照文献[5],RU486组及RU486+DAPT组大鼠腹腔注射RU486,注射剂量为20mg/(kg·d),RU486+DAPT组给予DAPT5μl(10μmol/L)玻璃体内注射给药(双侧眼球均给药)[6],CON组及DM组给予等剂量DMSO,12周后进行各项指标检测。实验遵循国家《实验动物管理条例》。

2.2样本制备:

12周后,在各组大鼠尾静脉取血3ml,5000r/min离心30min后取上清,运用ELISA法,检测血清GC浓度,操作按试剂盒说明书执行。每组取5只大鼠,固定后取出眼球,石蜡包埋切片,厚度为5μm,常温保存,用于免疫荧光及HE染色。每组另取5只大鼠取视网膜,裂解,冰上剪碎,冰上静置30min后4℃以2000r/min离心25min,留上清,-20℃保存用于Western印迹。

2.3免疫荧光检测大鼠视网膜Notch1表达:

经2.2制备的脱蜡后切片浸于PBS洗涤3次,每次3min;3%山羊血清+0.3%Triton-100室温孵育1h;不洗,滴加兔抗大鼠Notch1(1∶500),4℃过夜;PBS洗涤4次,每次3min;滴加荧光二抗,常温1h;PBS洗涤4次,每次3min;封片后荧光显微镜观察。

2.4Western印迹检测Notch1、Hes-1、GAP-43蛋白相对表达:

取2.2制备的上清,BCA法测蛋白浓度并制样,电泳分离后转入PVDF膜,1%BSA室温封闭2h。一抗(兔抗大鼠Notch1,1∶10000;兔抗大鼠Hes-1,1∶5000;小鼠抗大鼠GAP-43,1∶20000),4℃摇床杂交过夜。二抗室温2h。ECL显色,以β-Tubulin为内参,ImageJ软件分析灰度值。

2.5HE染色检测RGC密度:

经2.2制备的切片浸于PBS洗涤3次,每次3min;滴加苏木素,2min;PBS中1min,自来水冲洗;95%酒精1min;伊红浸染,2min,自来水冲洗;脱水透明后封片,拍照后应用ImageJ软件计数RGC数量并转化成密度。

3统计学方法

采用SPSS20.0统计学软件,符合正态分布的计量资料以x¯±sx¯±s表示,进行单因素方差分析,组间比较采用SNK检验,P<0.05为差异具有统计学意义。

3、结果

1各组大鼠血清GC水平检测结果

四组血清GC相比,总体具有统计学差异(F=75.36,P<0.05)。与CON组相比,DM组、RU486组及RU486+DAPT组血清GC浓度明显增加(P<0.05),而DM组、RU486组及RU486+DAPT组之间比较无统计学差异(P>0.05)。见表1。

表1各组大鼠血清GC和视网膜Notch1荧光强度

2免疫荧光检测各组大鼠视网膜Notch1的表达

将CON组Notch1蛋白免疫荧光强度设定为100.00%,四组之间相比,总体具有统计学差异(F=245.73,P<0.05)。与CON组相比,DM组及RU486+DAPT组Notch1表达明显降低,而与DM组相比,RU486组Notch1表达明显增加(均P<0.05),而DM组与RU486+DAPT组之间比较无统计学差异(P>0.05)(图1)。见表1。

3Western印迹检测视网膜Notch1、Hes-1、GAP-43蛋白相对表达量

与CON组相比,DM组及RU486+DAPT组GAP-43表达有所增加,Notch1和Hes-1表达明显降低(均P<0.05)。与DM组相比,RU486组Notch1、Hes-1及GAP-43表达均明显增加(均P<0.05)(图2),见表2。

4HE染色检测视网膜RGC

四组之间相比总体具有统计学差异(F=1264.82,P<0.05)。与CON组相比,DM组及RU486+DAPT组RGC密度明显降低(P<0.05)。

图1免疫荧光检测Notch1在视网膜的表达(×200)

图2Western印迹检测视网膜Notch1、Hes-1、GAP-43蛋白相对表达

与DM组相比,RU486组RGC密度明显增加(P<0.05),而DM组与RU486+DAPT组之间比较无统计学差异(P>0.05)。见表2、图3。

表2各组大鼠视网膜Notch1、Hes-1、GAP-43蛋白相对表达和RGC密度(x¯±s)(x¯±s)

图3四组视网膜HE染色(×200)

4、讨论

DR可引起RGC凋亡甚至死亡,表现为RGC数量的减少[7]。RGC轴突形成视神经,RGC损伤会影响患者的视力。因此,促进RGC再生增加其数量对防治DR尤为重要[8]。正常情况下,体内GC的增加会反馈于下丘脑、垂体,进而减少GC的释放。然而DR状态下,HPA轴反应性降低,GC对HPA轴负反馈作用减弱,促使GC浓度进一步增加[9]。RU486为GC的竞争性抑制剂,可阻碍GC与受体的结合,进而拮抗GC的作用。本研究发现,DR时血清GC浓度异常升高,RGC密度明显减少。RGC密度的降低可能由高血糖所致,亦可能由GC浓度的增加引起GC的慢性损伤所致。而RU486治疗后,RGC密度较DM组有所提高,提示针对GC的治疗对改善RGC损伤是有益的。有研究发现,针对STZ诱导的1型糖尿病大鼠给予RU486治疗9d后,可明显改善糖尿病引起的认知功能障碍[10]。亦有研究证实RU486对抑制糖尿病引起的实验性牙周炎具有较好的缓解作用[11]。因此,RU486针对糖尿病引起的GC浓度诱导的多种并发症具有很好的疗效。GAP-43为神经元再生的首选标志物,在神经元受损时表达明显上调[12]。本研究发现,DR时GAP-43表达有所提高,这可能是RGC对损伤的反应,这可能为RGC再生提供了条件。而应用RU486治疗后,GAP-43表达明显增加,伴随着RGC密度亦明显增多,提示针对GC浓度的增加进行治疗,可能促进RGC的再生,进而增加RGC密度。

Notch1信号可调节神经元生长,与神经元受损后的修复及再生密切相关[4]。通过上调Notch1表达,有助于周围神经元再生。本课题组前期发现,DR状态下Notch1信号通路受到抑制,激活该通路可上调视网膜GAP-43表达,下调Caspase-3表达,进而提高RGC的存活。本研究发现,与CON组相比,DM组Notch1表达明显下降,同时Notch1下游的关键位点Hes-1表达亦下降,这提示DR损伤会造成Notch1通路的抑制。而应用Notch1通路的抑制剂DAPT后RU486的治疗作用被逆转。因此,可以证实,RU486主要通过激活Notch1信号通路保护受损的RGC。

综上所述,DR状态下,Notch1通路的抑制会引起RGC密度的降低,而应用RU486后,可明显改善DR时的RGC损伤。进一步在RU486基础上加用Notch1通路的抑制剂DAPT后可逆转RU486的作用。这提示RU486对DR状态下RGC的保护作用与激活Notch1/Hes-1信号通路有关。

参考文献：

[3]刘文强,王玉波,左中夫,等.糖皮质激素对糖尿病大鼠视网膜神经元再生的影响[J].国际眼科杂志,2017,17(3):418-421.

[4]李泽平,陈彦霖,李晓苗,等.Mash-1基因对神经干细胞分化与神经发育的影响研究进展[J].陕西医学杂志,2019,48(3):404-406.

[8]张博,李凤君,左中夫.生长抑素对糖尿病大鼠视网膜病变的神经保护作用及对GFAP､突触素表达的影响[J].国际内分泌代谢杂志,2018,38(6):370-373.

刘文强,刘学政,左中夫.RU486通过Notch1/Hes-1信号通路对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞的保护作用及机制研究[J].陕西医学杂志,2020,49(06):656-658+671.

基金:国家自然科学基金资助项目(81571383);中国博士后科学基金资助项目(2017M612870);辽宁省自然科学基金资助项目(201602340);