慢性乙型肝炎（CHB）是全球流行疾病，约有20亿人曾感染过乙型肝炎病毒（HBV），其中慢性感染者有2.4亿人[1]，每年有约65万人死于HBV感染导致的肝脏疾病[2]。在我国，已确诊的CHB患者人数众多，并且发病率呈逐年上升趋势[3]。目前已证实，HBV感染的慢性化是导致肝纤维化、肝细胞癌（HCC）发生的主要原因[4]。近年来的多项研究显示，外泌体源性的微小RNA(miRNA）、长链非编码RNA(lncRNA）、蛋白质等可能参与了HBV感染所致肝炎、肝纤维化、HCC的发生、发展及转归，可能是HBV传播、感染、致病的一种重要媒介[5,6]。为理清外泌体参与HBV感染相关性肝脏疾病的发生、发展的机制，本文就该问题综述如下。

1、外泌体

外泌体是一种直径为30～100nm的磷脂双分子膜结构的细胞囊泡，广泛存在于血液、羊水、尿液、腹水、脑脊液、母乳、精液及胆汁等体液中[7,8]。外泌体可携带脂质、蛋白质、信使RNA(mRNA）、miRNA、lncRNA，甚至DNA等，将生物信息传递给受体细胞，在正常或疾病状态下发挥其生理及生物学作用[9]。长期以来，外泌体的功能被认为是去除细胞内不需要的“垃圾”蛋白质和核酸分子，而近期的研究表明，外泌体可作为细胞通信介质调控机体正常的生理过程，以及参与疾病的发生和发展[10]。

外泌体具有多种功能，既可以传递给受体细胞保护性的信号，又能导致受体细胞病理性损伤，这主要取决于外泌体来源的组织和携带的分子[10]。根据第4版外泌体数据库，来自各种生物和细胞的外泌体含有4563种蛋白质、194种脂质、1639种mRNA和764种miRNA[11]。其中外泌体RNAs，特别是miR-NA和lncRNA[12]，在细胞信号传导和交换的过程中发挥着调控靶细胞生理和病理活动的关键作用。病毒感染相关研究表明：外泌体一方面可通过激活抗病毒通路或传递抗病毒分子引起机体免疫应答；另一方面可传递病毒核酸和蛋白质，改变微环境，参与致病过程[13]。

2、外泌体与HBV感染

HBV感染引起的CHB在我国发病率较高，而HBV持续复制和机体免疫功能低下诱发的肝脏组织免疫损伤是导致乙型肝炎慢性化的主要原因。

2.1外泌体源性的HBV感染标志物

研究发现，外泌体参与病毒性肝炎的发生、发展过程，并且外泌体可作为病毒性肝炎等相关疾病的潜在分子标志物。在病毒性肝炎中，外泌体可以作为病毒、蛋白质、宿主RNA的携带者。JIA等[14]研究了来源于被HBV感染的Hepad38细胞分泌的外泌体，通过非标记定量蛋白质组学技术鉴定出1412个外泌体蛋白质，其中包括外泌体标志蛋白、肝功能相关蛋白、免疫相关蛋白以及蛋白酶复合物蛋白等。这些外泌体，尤其是被HBV感染且复制的Hepad38细胞分泌的外泌体和亚病毒颗粒能使PD-L1表达上调和CD69表达下调。这一改变说明：与未被HBV感染的Hepad38细胞分泌的外泌体相比，被HBV感染的Hepad38细胞分泌的外泌体和亚病毒颗粒具有很强的免疫抑制作用[15]。进一步研究发现，HBV感染者外周血血清分离出的外泌体中含有大量的病毒成分，包括HBV-DNA、HBV-RNA、乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）、蛋白质[16,17]。马越云[6]对8份血清标本（HBV-DNA水平在107IU/mL以上）进行检测，提取后的外泌体中HBV-DNA水平明显高于血清中HBV-DNA水平，最高可达9.8倍，提示外泌体是血清HBV-DNA的重要来源。此外，携带有HBV-DNA的外泌体，经荧光色素DiD标记并感染自然杀伤（NK）细胞后，可在NK细胞中检出外泌体和HBV-DNA，包括松弛环状DNA(rcDNA）和共价闭合环状DNA(cccDNA)[17]。以上研究显示，外泌体可通过抑制机体免疫功能促进HBV复制而使病毒转移、感染下一个细胞，外泌体源性的HBsAg、HBeAg、HBV-DNA等可能是细胞外HBV感染标志物的来源，故检测外泌体源性的HBV感染标志物有助于隐匿性感染的发现。

2.2外泌体源性的miRNA在HBV感染中的作用

肝脏细胞除了分泌包裹病毒成分的外泌体外，还可以分泌富含内源性mRNA、miRNA、lncRNA和蛋白质等效应分子的外泌体，并发挥多种生物学效应[18]。HBV可以调节miRNA的表达，并且HBV相关的miRNA可被分泌到细胞外囊泡中。有研究发现，HBV感染肝细胞分泌的外泌体miR-194-5p水平明显高于无HBV感染肝细胞分泌的外泌体miR-194-5p水平，这与CHB患者血清miR-194-5p水平高于健康对照者的结果一致[19]。为探讨巨噬细胞外泌体与CHB肝损伤的相关性，有研究者发现巨噬细胞外泌体miR-638水平在CHB中高表达，巨噬细胞外泌体可以明显地抑制HBV-DNA的复制，同时还发现HBV复制活跃期血清外泌体中miR-638的表达低于HBV非复制期，并且在HBV复制活跃期血清外泌体miR-638的表达与其自身的丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、HBV-DNA载量呈负相关[20]。HBV感染的肝细胞来源的外泌体miR-3也可抑制HBV-DNA的复制，外泌体miR-3直接与HBV3.5-kb转录物结合（HBV基因组2125～2145位），抑制HBsAg、HBeAg和乙型肝炎核心蛋白（HBc）的表达，减弱HBV的复制，可避免对肝细胞的损害[21]。外泌体源性的miRNA在HBV感染时传递细胞信号，并且可调控HBV-DNA的复制、转录，在HBV感染中发挥了重要的作用。

3、外泌体与肝纤维化

肝纤维化是一个动态过程，由病毒性肝炎及其他肝损伤引起，其发生机制复杂，最终导致失代偿期肝脏疾病和终末期肝脏疾病。肝星状细胞（HSC）是肝脏合成细胞外基质的主要细胞群，当肝脏发生炎症或受到损伤时，HSC被激活并转化为肌成纤维细胞，引起肝纤维化；HSC通过分泌作用对肝损伤作出反应，形成纤维瘢痕组织的胶原，而阻断HSC活化，可抑制肝纤维化的发生。外泌体在肝纤维化过程中的作用，取决于它们如何调控信号通路，是激活还是阻断HSC的活化。

3.1外泌体源性的miRNA在肝纤维化中的作用

miR-122被认为是肝脏特异性的miRNA，由肝脏分泌的miR-122被外泌体包裹转移至单核细胞，通过影响其靶标抗氧化蛋白血红素氧合酶-1(HO-1）和脂多糖（LPS），增强单核细胞炎性反应，造成肝损伤[22]。CHB患者血清miR-122水平显著高于健康人群，而肝纤维化晚期患者的miR-122水平降低，肝组织炎症活性较低[23]，说明miR-122可反映肝脏受炎症损伤的程度。近期研究发现，外泌体参与HSC的活化过程，人或小鼠HSC分泌的外泌体miR-214是HSC中结缔组织生长因子2(CCN2）依赖性肝纤维化发生的调节因子[24]，外泌体miR-214的减少主要在肝纤维化的初始阶段，并使CCN2在纤维化的肝脏中表达上调，通过HSC转移至相邻细胞而促进肝纤维化的形成[25]。而间充质干细胞分泌的外泌体miR-181-5p通过直接靶向Bcl-2和Stat3，减弱该基因表达，抑制HSC的活化，减少肝纤维化的发生[26]。同样，间充质干细胞的外泌体miR-125b通过抑制Hh信号转导，减少肝纤维化，有助于肝细胞再生[27]。此外，与肝纤维化形成有关的miRNA还包括：miR-181b、miR-125a-5p、miR-21、miR-27、miR-221、miR-222（以上miRNA促进肝纤维化的形成），miR-15b、miR-16、miR-29、miR-133a、miR-148a、miR-195、miR-378a（以上miRNA抑制肝纤维化的形成）[28]。文献[29]报道血清miR-181b和miR-106b联合检测诊断肝纤维化，尤其是早期肝纤维化，具有重大的临床价值。肝纤维化患者血清miR-125a-5p水平增高，其表达量与HBV-DNA和透明质酸、层粘连蛋白、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原等肝纤维化标志物的表达量呈正相关，而HCC患者血清miR-125a-5p水平降低[30]。miRNA被外泌体包裹转移到受体细胞内，介导肝纤维化的发生、发展，评估miRNA表达水平的变化有助于肝脏炎症损伤、纤维化及肿瘤疾病的监测。

3.2外泌体源性的lncRNA在肝纤维化中的作用

除了miRNA,lncRNA同样参与了肝纤维化的形成。有研究发现，在小鼠肝纤维化模型中肝组织分泌的lncR-p21表达显著降低。因为lncR-p21通过增强p21的表达阻碍原代HSC的细胞周期进程和增殖，抑制肝纤维化的形成；该研究还发现与健康受试者相比，肝硬化患者，尤其是肝硬化失代偿期患者血清lncR-p21水平同样显著降低[31]。ZHANG等[32]发现一种富含于肝脏的lncRNA———肝纤维化相关lncRNA1(lnc-LFAR1），可通过激活转化生长因子-β（TGF-β）和Notch信号增强HSC的活化而促进肝纤维化的发生、发展。lncRNA参与调控HSC的活化、增殖和凋亡，是肝纤维化研究的新热点，而外泌体源性的lncRNA在肝纤维化中的作用还需进一步探讨。

4、外泌体与HCC

国内HCC患者HBV感染率高达80%，有研究表明，外泌体在肿瘤生物学中发挥着重要的作用，HCC细胞分泌的外泌体影响局部肿瘤微环境，并且通过转移癌蛋白和核酸参与肿瘤的发生、发展和转移[33,34]。

4.1外泌体源性的miRNA在HCC中的作用

在HBV感染患者的HCC细胞中，研究者发现了一种HBV编码的miRNA，其被外泌体和HBV核心颗粒释放到循环中参与HCC的发生、发展。通过观察20例HBV阳性HCC患者和3例HBV阴性HCC患者中miR-3的表达，发现肝组织来源的miR-3在HBV阳性HCC细胞中高表达，而在HBV阴性HCC细胞中不表达[21]，提示miR-3很可能是HBV感染患者肝组织分泌的特异性miRNA。巨噬细胞分泌的外泌体miR-142、miR-223被巨噬细胞以细胞接触依赖性方式转移到HCC细胞，从而影响HCC细胞内蛋白质的转录后调节以及内源性表达的stathmin-1和胰岛素样生长因子-1受体，进而在功能上抑制HCC细胞的增殖[35]。有研究发现在二乙基亚硝胺诱导的HCC大鼠模型中，肝组织及血液样品中miR-21随着肝脏炎症损害的加重而增高，联合检测miR-21、miR-10b和甲胎蛋白（AFP）有望成为早期诊断HCC的生物学标志物[36]。同样，TIAN等[37]发现外泌体miR-21和miR-10b可促进HCC细胞的增殖和转移，血清外泌体miR-21和miR-10b水平与HCC分期和低氧诱导因子（HIF)-1α、HIF-2α的表达相关，并且是HCC患者生存的独立预测因素。关于外泌体miRNA对HCC诊断及预后价值的相关报道还包括：血清外泌体miR-221、miR-191、miR-181a、miR-26a可早期诊断HCC[38],miR-125b[39]、miR-638[40]、miR-665[41]可评估HCC患者的预后。这些研究有助于HCC患者的早期诊断及预后评估，同时miRNA在肿瘤中的通讯和转移也可能是肿瘤细胞免疫防御的新机制。

4.2外泌体源性的lncRNA在HCC中的作用

有研究报道，来自癌症患者的外泌体lncRNA也可能成为新的肿瘤生物标志物[42]，甚至有望成为HCC诊断及疗效判断的指标[43]。部分lncRNA在HCC细胞来源的外泌体内富集，如lncRUnigene56159在HBV相关的HCC组织中显著上调，lncRUnigene56159可以直接与miR-140-5p结合，并有效地作为miR-140-5p的竞争性内源RNA(ceRNA）去抑制靶基因Slug的表达，而促进HCC细胞的迁移和转化[44]。CD90阳性HCC细胞通过分泌外泌体lncRH19作用于内皮细胞，促进肿瘤血管生成，增强邻近HCC细胞的增殖和侵袭能力，在HCC的发生和转移中发挥作用[45]。LEE等[46]分析了HCC组织和匹配的正常肝脏组织的临床标本，通过检测组织及血清外泌体中lncRNA的表达，发现lncRATB在HCC中显著上调，而lncRMEG3在HCC中下调，并且lncRATB的表达与HCC患者的肿瘤大小和不良预后显著相关。外泌体源性的lncRNA不仅影响HCC的发生和发展，还有助于评估肿瘤患者的预后。

5、小结

综上所述，外泌体参与了HBV感染所致的肝炎、肝纤维化，HCC的发生、发展及转归，评估外泌体源性的病毒感染标志物，以及相关miRNA、lncRNA等的表达，可为HBV感染相关肝脏疾病的诊疗选择新的生物学标志物，同时外泌体也为HBV感染相关肝脏疾病的发生机制提供了新的研究视角。

目前有关外泌体与肝脏疾病的研究尚处于初期阶段，还需大量的临床标本以及循证医学进一步验证。外泌体还可作为化疗佐剂、免疫疗法载体，本文虽未详述，但这也是临床诊疗所关注的重点。而外泌体源性miRNA、lncRNA、蛋白质所介导细胞间的信号通路、激活机体的免疫应答机制以及作为治疗的有效载体仍是今后研究的方向。

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基金:新疆维吾尔自治区卫生健康青年医学科技人才专项科研项目(WYWY-202010)