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香参丸对结肠炎小鼠结肠黏膜TLRNF-κB信号的调控作用

2021-09-28 84 上传者：管理员

摘要：目的:基于Toll样受体(TLR)/核转录因子-κB(NF-κB)经典信号通路,探究香参丸对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠溃疡性结肠炎(UC)的作用及机制。方法:实验小鼠分为正常组,模型组,香参丸组,美沙拉嗪组。除正常组外,其余各组均自由饮用3%DSS溶液7d以建立急性UC模型,从造模第1天至第10天连续予香参丸(5g•kg-1)和美沙拉嗪(300mg•kg-1)给药治疗,分别观察各组小鼠体质量,疾病活动指数(DAI),结肠质量,肠重指数,结肠长度,单位长度结肠质量和结肠病理改变以评价其疗效,同时蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测小鼠结肠组织内TLR5,髓样分化因子88(MyD88),白细胞介素-1受体相关激酶4(IRAK4),肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6),转化生长因子-β活化激酶1(TAK1),p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK),NF-κB,白细胞介素-1受体相关激酶1(IRAK1),转化生长因子-β活化激酶1结合蛋白1(TAB1),转化生长因子-β活化激酶1结合蛋白2(TAB2),丝裂原活化蛋白激酶激酶3(MKK3),丝裂原活化蛋白激酶激酶6(MKK6),环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组小鼠体质量减轻,DAI评分升高,结肠质量,肠重指数和单位长度结肠质量升高,结肠长度缩短,结肠黏膜损伤严重,结肠组织TLR5,MyD88,IRAK4,TRAF6,TAK1,p38MAPK,NF-κB,IRAK1,TAB1,TAB2,MKK3,MKK6,CREB蛋白表达均明显上升(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,香参丸组和美沙拉嗪组小鼠体质量增加,DAI评分下降,结肠质量,肠重指数和单位长度结肠质量降低,结肠长度增加,结肠黏膜损伤程度好转,结肠组织TLR5,MyD88,IRAK4,TRAF6,TAK1,p38MAPK,NF-κB,IRAK1,TAB1,TAB2,MKK3,MKK6,CREB蛋白表达明显下降(P<0.05,P<0.01)。结论:香参丸有效治疗DSS诱导的小鼠UC,可能与其抑制TLR/NF-κB信号通路有关。

关键词：
Toll样受体(TLR)/核转录因子-κB(NF-κB)通路
溃疡性结肠炎
疗效评价
香参丸
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疡性结肠炎（UC）是主要发生在黏膜层的以溃疡为主的慢性复发性肠道炎症疾病，临床表现为体质量下降、腹痛、腹泻、血便、严重者甚至会发生癌变，病程反复发作，复发-缓解相交替。其病因病机复杂，受到环境、遗传、感染、免疫等因素的共同作用，而免疫功能失调在其中发挥了重要作用[1]。Toll样受体（TLRs）是存在于免疫细胞表面的一种模式识别受体（PRR），通过识别病原相关分子模式（PAMPs）激活TLR/核转录因子-κB(NF-κB）信号传导途径，诱导促炎细胞因子表达及释放，造成肠道炎症反应，肠黏膜损伤[2]。

UC属于中医学的“肠风”“痢疾”“泄泻”“五更泻”等范畴，香参丸出自清代医家吴世昌的《奇方类编》，由木香、苦参、甘草3味中药组合而成，书中载“治红白痢极效”。临床上多用来治疗结肠炎，细菌性痢疾等各种泻痢，但其作用机制尚不明确[3]。课题组前期研究证明香参丸对实验性溃疡性结肠炎大鼠有较好的疗效[4,5]，鉴于TLR/NF-κB信号途径与结肠炎的密切关系，本研究拟从TLR/NF-κB信号通路角度探讨香参丸治疗UC的作用机制，为香参丸的临床应用提供理论依据。

1、材料

1.1动物及分组

40只SPF级雄性健康BALB/c小鼠，体质量20～22g，购自于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号SCXK（湘）2016-0002。本实验获得江西中医药大学实验动物伦理委员会批准（动物伦理委员会编号JZLLSC20160622001），符合中国伦理委员会指导原则。清洁级动物房饲养，统一光照时间为6:00～18:00，恒温，恒湿，自由饮水，饲固体饲料。适应性喂养3d后用于实验。40只小鼠随机分为正常组、模型组、香参丸组、美沙拉嗪组，每组10只。

1.2药品与试剂

木香配方颗粒和苦参配方颗粒（江阴天江药业有限公司，批号分别为18040311,17120531）；甘草配方颗粒（广东一方制药有限公司批号8060361）；美沙拉嗪肠溶片（葵花药业集团佳木斯鹿灵制制药有限公司，批号200818）；便隐血试剂（珠海贝索生物技术有限公司，批号BA-2020B）；苏木素-伊红（HE）染液（南京建成科技有限公司，批号20190902）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH),TLR5，髓样分化因子88(MyD88），白细胞介素-1受体相关激酶4(IRAK4），肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6），转化生长因子-β活化激酶1(TAK1),IRAK1,TAK1结合蛋白1(TAB1），丝裂原活化蛋白激酶激酶3(MKK3),MKK6，山羊抗兔，山羊抗小鼠抗体（英国Abcam公司，批号分别为ab181602,ab13876,ab2064,ab119942,ab40675,ab109526,ab238,ab76412,ab195037,ab154901,ab205718,ab205719);p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK),NF-κB,TAB2，环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）抗体（美国CST公司，批号分别为8690S,8242S,3745S,9197S）。

1.3仪器

Neofuge13Rxing型高速冷冻离心机；EG1150型石蜡包埋机，RM2255型石蜡切片机（德国Leica公司）；BX43型光学显微镜；041BR137750型电泳仪，MiniPROTEANTeraCell型转膜仪；FluorChemM凝胶成像系统。

2、方法

2.1模型复制与给药

除正常组外，小鼠饮用3%DSS溶液7d造成急性UC模型[6]。从饮用DSS溶液的第1天起，按大鼠给药剂量2.5g·kg-1换算小鼠给药剂量[5]，香参丸组给予5g·kg-1香参丸混悬液（木香-苦参-甘草2∶3∶5），美沙拉嗪组按300mg·kg-1给予美沙拉嗪混悬液，正常组和模型组小鼠均给予等体积的生理盐水，固定时间段灌胃1次/d，共10d。动物饲养期间自由饮食及饮水。

2.2标本采集

末次给药后，禁食不禁水12h，小鼠经2%戊巴比妥钠深度麻醉后眼球取血后，处死动物，分离结肠组织，距肛门4cm处截取1～2cm的结肠组织放入4%多聚甲醛溶液中固定，剩余结肠组织冻存管分装，放置-80℃冰箱保存。

2.3指标检测

2.3.1小鼠一般生活习性观察及疾病活动指数评分

每日同一时间观察并记录小鼠体质量变化，精神状态，毛发色泽，粪便性状，便血情况，并根据疾病活动指数评分标准[7]对小鼠进行DAI评分，评分标准如下，(1)体质量：无明显下降，0分；下降1%～5%,1分；下降6%～10%,2分；下降11%～20%,3分；下降超过20%,4分。(2)粪便黏稠度：正常粪便，0分；松软便（干性），2分；稀便或腹泻（水样便），4分。(3)便血情况：无出血，0分；大便潜血阳性，2分；粪便带血，3分；肛门出血，4分。DAI评分=体质量下降分数+粪便黏稠度分数+便血分数。

2.3.2检测结肠质量、肠重指数、结肠长度、单位长度结肠质量

将结肠组织自然铺展于冰袋上测量结肠长度并拍照，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗肠腔后，滤纸吸去多余水分，电子天平称取结肠质量，计算肠重指数及单位长度结肠质量。肠重指数=结肠质量（g）/小鼠体质量（g）×100%，单位长度结肠质量=结肠质量（g）/结肠长度（cm）。

2.3.3结肠组织病理学观察

结肠组织多聚甲醛固定后，放入包埋盒，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切成厚度为4μm的结肠组织，二甲苯脱蜡，梯度水化后进行HE染色，中性树胶封片，晾干后光学显微镜下观察小鼠结肠组织形态和病理损伤情况，并根据镜下病理组织学损伤评分标准[8]进行组织学病理损伤评分。评分标准如下，(1)炎性细胞浸润程度：无炎细胞浸润，0分；固有层炎细胞数量增加，1分；炎细胞浸润至黏膜下层，2分；透壁性炎细胞浸润，3分；(2)组织损伤程度：无黏膜损伤，0分；散在上皮损伤，1分；局灶性溃疡形成，2分；广泛性溃疡形成延伸至肠壁，3分。

2.3.4蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测结肠组织中TLR/NF-κB信号通路相关蛋白表达

取已加入RIPA裂解液，PMSF蛋白酶抑制剂的结肠组织匀浆液，13000r·min-1离心40min（离心半径7cm），取上清液20μL用于检测蛋白浓度，剩余量加入相应体积的蛋白上清缓冲液振荡混匀。加热使蛋白变性后待其自然冷却，分装。取蛋白50μg上样，电泳，转膜，封闭后，分别用5%BSA按1∶1000的比例稀释一抗抗体4℃摇床孵育过夜，用5%BSA按1∶1万的比例稀释IgG二抗，摇床室温孵育1.5h,TBST清洗后，滴入显影液在凝胶成像系统成像，采用ImageJ1.52v软件进行定量分析，以内参GAPDH计算蛋白相对表达量。

2.4统计学分析

采用SPSS22.0和GraphPadPrismsoftware8.0软件进行数据处理，两组间比较使用t检验，实验数据用表示，P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1对结肠炎小鼠体质量及DAI评分的影响

与正常组比较，模型组小鼠体质量明显下降（P<0.05），精神萎靡，食欲减退，毛发暗淡，腹泻，血便，经香参丸和美沙拉嗪药物治疗后，小鼠体质量明显升高（P<0.05,P<0.01），精神状态良好，食欲增加，毛发光泽，腹泻及血便情况好转，自饮用3%DSS溶液第3天起，模型组小鼠DAI评分明显升高（P<0.05,P<0.01），至第7天达到顶峰，与模型组比较，香参丸组和美沙拉嗪组DAI评分明显下降，差异有明显统计学意义（P<0.05）。停DSS继续给药治疗3d至实验结束时，各给药组DAI评分较模型组均有明显下降（P<0.05）。见表1。

3.2对结肠炎小鼠结肠质量、肠重指数、结肠长度、单位长度结肠质量的影响

与正常组比较，模型组小鼠结肠质量明显增加，肠重指数升高，结肠长度显著缩短，单位长度结肠质量呈上升趋势（P<0.05,P<0.01）；与模型组比较，经香参丸和美沙拉嗪治疗后，小鼠结肠质量和肠重指数明显下降，结肠长度增加，单位长度结肠质量明显降低（P<0.05,P<0.01）。见表2。

3.3对结肠炎小鼠结肠组织病理学损伤的影响

与正常组比较，DSS诱导的结肠炎小鼠结肠黏膜受损，大量的炎性细胞浸润，溃疡数增多，腺体排列紊乱，隐窝结构破坏，隐窝数量减少，杯状细胞减少，组织学评分显著升高（P<0.01）；与模型组比较，给药组小鼠结肠黏膜受损情况改善，炎性细胞浸润减少，溃疡数减少，腺体排列规则，隐窝结构恢复，隐窝数量增加，杯状细胞明显增多，组织学评分明显降低（P<0.05）。见图1，表3。

3.4对结肠炎小鼠结肠组织中TLR/NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

与正常组比较，DSS诱导的模型组小鼠结肠组织中的TLR5,MyD88,IRAK4,TRAF6,TAK1,p38MAPK,NF-κB,IRAK1,TAB1,TAB2,MKK3,MKK6,CREB蛋白表达水平明显上升（P<0.05,P<0.01）；经药物治疗后，与模型组比较，治疗组小鼠结肠组织中的以上蛋白表达水平明显下降（P<0.05,P<0.01）。见图2，表4。

4、讨论

当前UC的药物治疗包括氨基水杨酸，糖皮质激素，免疫抑制剂及生物制剂等，但受制于治疗成本高，毒副作用大，患者耐受差，而中医药具有价格低廉，患者耐受好，毒副作用小的独特优势。香参丸具有清热解毒，行气止痛之功，主治热痢，血痢，广泛应用于临床治疗，而关于香参丸的作用机制及途径还知之甚少。

TLRs通过识别病原体或宿主凋亡细胞表面的共有特定分子结构病原相关分子模式引发先天性免疫反应，诱导大量炎性细胞因子产生，加重炎症反应。NF-κB存在于几乎所有细胞的细胞质中，是重要的转录调节因子，与免疫调节密切相关。有研究证实，在溃疡性结肠炎患者结肠黏膜中TLR4,NF-κBp65表达显著上调，且与炎症程度呈正相关，加速了结肠炎的发生发展[9]。降低TLR4,MyD88,NF-κB的表达可减轻炎症反应，表明TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活参与了溃疡性结肠炎的发展[10,11]。

TLRs信号通路包括MyD88依赖性信号途径和TRIF依赖性信号途径，两者均以转录因子NF-κB的激活而告终[12]。TLR激活后，MyD88的死亡结构域与IRAK家族成员的死亡结构域相互作用，最先被激活的是IRAK4,IRAK4发生磷酸化并激活IRAK1，后与TRAF6相互作用，TRAF6活化后与由TAK1和TABs(TAB1,TAB2）组成的蛋白激酶复合物结合，然后激活IKK复合物和MAPK两种不同的途径，IKK途径则进一步激活IκB，释放转录因子NF-κB；而激活p38MAPK途径需要活化MKK3,MKK6,p38MAPK途径活化后释放转录因子AP-1和CREB进入细胞核，调控炎性细胞因子的表达。在TRIF依赖性信号途径中，TLRs与TRIF相结合后激活TRAF6，以类似于MyD88依赖途径的方式活化TAK1，激活NF-κB并进入细胞核内，与靶基因的启动子结合，促进靶基因的转录[13]。

前期的研究表明，香参丸降低结肠组织中IL-2,TGF-β水平以及小肠PP结中CD4+T淋巴细胞水平，提高CD8+T淋巴细胞水平，调节CD4+,CD8+T细胞亚群的平衡[4]；抑制结肠黏膜ADH,ChAT和NADP+表达，升高ACh和MAO表达[5]，而有效治疗溃疡性结肠炎。有研究表明苦参，木香的有效成分能有效治疗结肠炎，缓解结肠组织损伤。氧化苦参碱是从苦参中分离出来的生物碱成分。氧化苦参碱能降低结肠组织中TLR9,NF-κBmRNA的表达，减轻结肠组织损伤[14]；抑制结肠组织中NF-κBp65,IL-2表达，减轻TNBS诱导的结肠炎症反应[15]；下调巨噬细胞RAW264.7中TLR7,TNF-αmRNA的表达，抑制小鼠脾淋巴细胞TLR7,MyD88,TRAF-6mRNA的表达，影响免疫细胞表达TLR7[16]。去氢木香内酯为木香的主要活性成分，具有抗炎，抗肿瘤等作用。去氢木香内酯通过降低TNF-α，IL-6,IL-17,IL-23表达，修复肠黏膜屏障相关蛋白粘蛋白2(MUC2)MUC2，α-防御素（α-defense），下调NF-κB,STAT3表达，来维持肠黏膜屏障完整性，抑制炎症信号通路的活化[17]。因此，充分的研究表明，香参丸或其有效组分存在调控TLR/NF-κB信号通路治疗结肠炎的物质基础。在本研究中，经香参丸治疗后，结肠炎小鼠体质量增加，DAI评分下降，结肠质量、肠重指数和单位长度结肠质量均显著升高，结肠长度明显增加，炎性细胞浸润减少，结肠黏膜损伤减轻。同时，香参丸显著降低结肠组织TLR/NF-κB信号通路相关蛋白的表达，表明香参丸治疗结肠炎的作用机制可能与抑制TLR/NF-κB信号通路的活化有关。然而本研究也存在一些局限性，尚未使用TLR/NF-κB信号核心基因敲除小鼠和该信号抑制剂及激动剂进行参照，有待于进一步深化研究。随着香参丸作用机制，作用靶点及其有效组分的研究不断深入，香参丸或其有效组分或将可能成为治疗溃疡性结肠炎的潜在药物之一。