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JNK信号通路探讨益肾调督针法对脑缺血再灌注大鼠神经细胞凋亡
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摘要：目的 基于c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路探讨益肾调督针法对脑缺血再灌注大鼠神经细胞凋亡的调控作用。方法 选取40只SPF级Wistar大鼠，将40只大鼠分为假手术组假10只、模型组15只、益肾调督针法组15只，建立脑缺血再灌注模型，模型组益肾调督针法组各有10只大鼠建模成功。假手术组和模型组每天相同时间、相同程度的捉抓，但不针刺，益肾调督针法组进行针刺治疗。观察大鼠一般情况、神经功能、病理组织学、神经细胞凋亡数、JNK荧光强度、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-9蛋白表达情况。结果 与假手术组相比，模型组、益肾调督针法组神经损伤严重程度评分(mNSS)显著升高(P<0.05);与模型组相比，益肾调督针法组mNSS显著降低(P<0.05)。与假手术组相比，模型组、益肾调督针法组海马组织中神经细胞凋亡数、JNK荧光强度、Bax、Caspase-3、Caspase-9表达显著升高，Bcl-2表达显著降低(P<0.05);与模型组相比，益肾调督针法组神经细胞凋亡数、JNK荧光强度、Bax、Caspase-3、Caspase-9表达显著降低，Bcl-2表达显著升高(P<0.05)。结论 益肾调督针法可改善脑缺血再灌注大鼠神经损伤状态，减少神经细胞凋亡，其作用机制可能与JNK活化相关。
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缺血性脑病在临床疾病中较为常见，临床致死率、致残率较高，可对人类健康造成较大威胁[1]。缺血再灌注为多数缺血性脑血管疾病的主要病理过程，可损伤机体内脑组织，且再灌注可加重缺血损伤，并将其可逆转损伤转化为不可逆损伤[2]。研究显示[3],缺血再灌注损伤时机体内存在细胞凋亡状况，其在缺血再灌注损伤中作用较为重要。督脉贯脊属肾络脑，与脑关系密切，故针刺百会、风府、大椎、命门穴，能够调节脑神经，改善脑功能。脑为髓海，肾藏精生髓，充养脑髓，以养元神，故针刺肾俞、太溪能补益肾精，滋养脑髓[4]。c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路可调控脑缺血损伤后神经凋亡过程，在脑缺血介导的神经元死亡中作用不同，阻断JNK信号通路，可使细胞的凋亡受到抑制，保护机体神经功能[5]。本文基于JNK信号通路探讨益肾调督针法对脑缺血再灌注大鼠神经细胞凋亡的调控作用，以明确益肾调督针法与脑缺血再灌注损伤的关系。
1、材料与方法
1.1研究动物
SPF清洁级雄性SD大鼠40只，体质量250～280 g,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCXK(湘)2019-0004。于广西中医药大学科研实验中心分笼饲养，环境清洁、安静、通风良好，自由进食、饮水。实验研究通过广西中医药大学伦理委员会审查(审查证书编号：DW20200107-004)。
1.2分组与建模
适应性喂养5 d后，将40只大鼠分为假手术组10只、模型组15只、益肾调督针法组15只，参照李世英等[6]建立脑缺血再灌注模型，将10%水合氯醛注入大鼠腹腔，对大鼠进行麻醉，使大鼠处于仰卧位，将其固定于手术台，在大鼠左侧颈旁制作切口，将其皮下组织分离，暴露出颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，将颈外动脉主干进行缝扎，后将颈总动脉近颈部剪一切口，插入鱼线头，松开微动脉夹，向上推鱼线，至大脑中动脉入口处，后在切口上方结扎，逐步缝合切口，将栓线与皮肤外留5 cm,缺血1 h后将线栓取出，制作缺血再灌注损伤模型，假手术组只分离颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，不结扎不栓线。模型组、益肾调督针法组各有10只大鼠建模成功。
1.3治疗方法
建模成功后第2天对大鼠进行治疗，假手术组和模型组每天相同时间、相同程度的捉抓，但不针刺，益肾调督针法组进行针刺治疗，取大鼠百会、风府、大椎、命门、肾俞、太溪穴，采用手捻针，百会、风府、大椎用平补平泻手法，命门、肾俞、太溪用补法，留针20 min, 5 min行针1次。
1.4指标观察
(1)一般情况观察。于治疗前对各组毛发色泽、精神状况、活动情况、姿态等一般情况进行观察。(2)神经功能检测。采用神经损伤严重程度评分(mNSS)评分评价大鼠神经功能缺损程度，包括运动、感觉、反射3个方面，总分为14分，轻度缺损：1～4分，中度缺损：5～9分，重度缺损：10～14分。(3)病理组织学观察。将大鼠断颈处死，取大鼠海马组织，各剪取0.5 g储存于-80℃,在多聚甲醛中固定4 h,采用乙醇对其进行脱水处理，后进行石蜡包埋，制作5μm薄片，进行脱蜡、脱水操作，并采用HE染色试剂盒进行染色，光学显微镜观察其病理变化。(4)神经细胞凋亡数、JNK荧光强度检测。取大鼠海马组织，采用流式细胞仪对大鼠神经细胞凋亡数、JNK荧光强度进行检测。(5)B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-9蛋白检测。通过Western印迹对海马组织中的Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白进行检测，将各组大鼠海马组织剪碎后加入裂解液，进行30 min裂解，以离心半径3 cm,转速3 000 r/min离心处理10 min,取上清液，做二喹啉甲酸(BCA)蛋白定性检测，将样品上样至8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶上，经电泳后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用磷酸盐缓冲液(PBS)封闭2 h后，加入TBST稀释的羊抗鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9(1∶2 500)一抗，后4℃孵育过夜，洗膜3次，加入1∶10 000的稀释羊抗鼠二抗，温室孵育1 h,做TBST洗膜3次，以GAPDH为内参照，定量分析蛋白表达情况，重复试验3次。
1.5统计学处理
采用SPSS19.0统计软件进行方差齐性检验、重复测量方差分析。
2、结 果
2.1一般情况观察
假手术组活动、进水正常，有精神，毛发顺滑有光泽，模型组毛发枯燥，进食减少，精神萎靡。益肾调督针法组饮水、进食、活动恢复正常，毛发顺滑、光泽度改善。
2.2各组神经功能对比
如表1所示，与假手术组相比，模型组、益肾调督针法组mNSS评分升高，具有统计学差异(P<0.05);与模型组相比，益肾调督针法组mNSS评分降低，具有统计学差异(P<0.05)。
2.3各组海马区病理学特征对比
如图1所示，假手术组海马区细胞排列整齐，细胞形态正常，核仁清晰，且框架结构完整；模型组海马区细胞排列紊乱、稀疏，神经细胞缺少，核仁较深，益肾调督针法组海马区细胞水肿、神经细胞缺失、变形减轻。
2.4各组海马区神经细胞凋亡数、JNK荧光强度对比
如表1所示，与假手术组相比，模型组、益肾调督针法组神经细胞凋亡数、JNK荧光强度升高，具有统计学差异(P<0.05);与模型组相比，益肾调督针法组神经细胞凋亡数、JNK荧光强度降低，具有统计学差异(P<0.05)。
2.5各组海马区Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达
如表1所示，与假手术组相比，模型组、益肾调督针法组Bcl-2表达明显降低，Bax、Caspase-3、Caspase-9表达明显升高(P<0.05);与模型组相比，益肾调督针法组Bcl-2表达升高，Bax、Caspase-3、Caspase-9表达降低，具有统计学差异(P<0.05)。
表1各组神经功能、海马区神经细胞凋亡数、JNK荧光强度及Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达对比
图1各组海马区病理(HE染色，×400)
3、讨 论
脑缺血再灌注损伤为脑部缺血后，使脑细胞发生损伤，缺血区恢复血供后，使缺血性脑损伤进一步加重，增加脑细胞死亡数量，使机体病情加重，对人们身体健康造成威胁，故临床对此过程进行缓解较为重要[7,8]。
缺血性脑卒中在中医学中属于“中风”范畴，多是由风、火、痰、瘀导致“窍闭神匿、神不导气”引起的，临床主要采用病变在脑、首取督脉的理论方式对患者进行治疗[9]。益肾可使机体内肾精保持充足，调督可振奋机体内阳气，对全身脏腑功能进行调节，使人体的精神意识得到改善，百会穴为督脉，为百脉之会，具有通络理气、熄风开窍、醒脑开窍的作用[10]。本研究显示，采用益肾调督针法对脑缺血再灌注大鼠进行干预，可减轻大鼠体内神经细胞凋亡，抑制JNK信号通路，减轻大鼠神经元损伤。
脑缺血再灌注损伤过程为脑细胞死亡过程，脑缺血再灌注后，可产生氧自由基、炎症因子，导致细胞凋亡，使神经元坏死，导致神经功能缺失[11,12]。研究显示[13～15],缺血早期可使缺血中心区脑血流量降低，神经细胞坏死，造成脑部损伤，对细胞凋亡进行控制，减轻缺血半暗区细胞损伤，在缺血性损伤严重程度控制中具有重要意义。JNK信号通路可通过细胞应激激活，在细胞凋亡、应激反应、疾病发展中具有重要作用，JNK的3个异体结构在脑缺血介导的神经元死亡中具有不同作用，JNK的激活可促进脑缺血再灌注损伤的细胞凋亡[16,17]。本研究发现，采用益肾调督针法对缺血再灌注大鼠进行干预，可抑制JNK信号通路激活，降低大鼠神经细胞凋亡水平，使其神经功能得到改善，减轻大鼠脑损伤。研究表明[18],益肾调督针法可对血管活性物质进行调整，并降低脑缺血再灌注区炎症反应，抑制JNK信号通路激活，减轻脑组织神经损伤，保护脑组织。该研究与本研究保持一致，表明经益肾调督针法干预，可改善机体神经功能，减少神经细胞凋亡，减轻脑部损伤。
研究显示[19,20],细胞凋亡可受到多种基因的控制，Bcl-2为凋亡相关基因，分布于线粒体外膜处，Bcl-2可分为抑制细胞凋亡蛋白、促进细胞凋亡蛋白，Bax为促细胞凋亡蛋白，且表达升高，可使细胞凋亡加快，Bcl-2表达升高，可抑制细胞的凋亡。Caspase-3、Caspase-9为细胞凋亡过程中关键蛋白酶，其表达水平升高，可使细胞凋亡增加[21,22]。JNK信号通路激活后，可作用与线粒体，使细胞色素(Cyt)-C进入胞质，与Caspase-9结合，作用于Caspase-3,导致细胞凋亡[23,24]。本研究发现，采用益肾调督针法对大鼠进行干预，抑制JNK信号通路激活，使Bcl-2表达升高，Bax、Caspase-3、Caspase-9表达降低，减少机体内细胞凋亡，改善机体脑损伤。研究表明[25],JNK信号通路激活后，可使Caspase-3的表达升高，导致脑缺血再灌注损伤的发生，益肾调督针法可降低炎症因子表达，抑制JNK信号通路激活，促进细胞的存活，保护神经功能。该研究与本文研究保持一致，表明采用经益肾调督针法干预，可抑制JNK信号通路激活，减少Caspase-3、Caspase-9分泌，减轻细胞损伤。
综上所述，脑缺血再灌注大鼠经益肾调督针法干预后，病变明显被抑制，神经细胞凋亡减少，Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达得到改善，其作用机制可能与大鼠JNK信号通路被抑制相关。
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基金资助:广西自然科学基金项目(2020GXNSFAA259066);广西中医药重点学科建设项目(GZXK-Z-20-38);广西中医药大学校级博士研究生科研创新项目(YCBXJ2021002);
文章来源:冯卓,李季,赵晓君,等.基于JNK信号通路探讨益肾调督针法对脑缺血再灌注大鼠神经细胞凋亡的调控作用[J].中国老年学杂志,2024,44(21):5304-5307.
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中风后失语(失语症)是中风病常见的后遗症之一[2],无特效临床用药,在古代有“喑痱”“舌强”“风懿”“语言謇涩”“言语不利”等称谓｡研究表明有30%以上的患者在中风病发病早期是会出现不同程度的失语,三分之一以上的患者在中风病治疗后期仍备受困扰,甚至终生相伴[3],给患者身心健康带来极大痛苦｡
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随着现代医学技术的不断发展,介入治疗作为一种微创､精准的治疗手段,已广泛应用于多种疾病的诊治｡ 然而,介入手术虽然创伤小,但患者术前的心理压力和术后的康复管理仍对其治疗效果有重要影响｡ 尤其是脑血管介入手术,由于患者存在认知功能损伤或生活能力降低,导致患者配合较差影响治疗效果｡
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2024-11-12
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