慢性脑缺血(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)，又称慢性脑低灌注，是一种由于多种原因引起的脑血管结构性病变和/或血液浓度及血流动力异常性低灌注，导致大脑整体水平或前、后循环供血区域性血供减少的一种病理状态。临床上患者主要表现包括头痛、头胀等症状，可能伴有高血压、眼底动脉硬化改变或脑灌注动脉的血管杂音[1]。长期慢性的全脑或局部脑缺血低灌注易导致皮层和海马缺血缺氧，诱发迟发性神经元损伤，最终发展为严重的认知功能障碍综合征，严重影响了患者的日常生活。目前，治疗慢性脑缺血多侧重于抗血小板聚集、抗凝、改善循环及脑代谢等药物。虽然这些治疗方法效果肯定，但常伴有不确定的不良反应。因此，寻找有效的治疗策略对于改善患者预后具有重要意义。

中医临床将慢性脑缺血归类于“眩晕”“不寐”“痴呆”“郁病”等范畴，其治疗宗旨在于活血化瘀、益气通络。上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院奚九一教授根据中医理论和长期临床实践总结拟订中药复方鳖甲软脉汤，由鳖甲、垂盆草、石菖蒲、白芍、黄芪、续断、甘草、川芎组成，具有软坚解痉、清热解毒、益气活血的功效，在临床上用于治疗经络不畅导致的结缔组织增生及外周小血管循环不畅等症状，具有非常好的临床疗效[2]。基于此，本研究旨在探究鳖甲软脉汤对慢性脑缺血小鼠的学习和记忆障碍的改善作用，并初步揭示其潜在的作用机制。

本实验采用双侧颈总动脉狭窄(bilateral common carotid artery stenosis，BCAS)法在C57小鼠上制备慢性脑缺血模型。术后1个月开始连续灌胃给药12周，假手术组和模型组连续灌胃等量生理盐水，其余给药组灌胃给予相应药物。利用Morris水迷宫和新物体识别实验评估小鼠的学习记忆能力，并通过组织染色和免疫印迹实验等方法，检测小鼠脑组织的病理变化和相关蛋白的表达情况，阐明鳖甲软脉汤改善慢性脑缺血小鼠的学习和记忆障碍的作用机制。

1、材料

1.1实验动物

SPF级25～30 g健康雄性C57BL/6小鼠[动物生产合格证号：SCXK(苏)2021-0013]，均饲养于SPF级动物房，实验中自由获取水和食物。环境温度(22±3)℃，相对湿度(60±10)%，12 h明/暗交替。受试小鼠经适应性饲养1周后再进行实验。整个实验过程严格遵照上海大学实验动物伦理委员会要求，伦理编号为No.ECSHU 2023-009。

1.2试药

银杏叶提取物(上海阿拉丁生物化学技术公司，批号：G195711)。鳖甲软脉汤由鳖甲、垂盆草、石菖蒲、白芍、黄芪、续断、甘草、川芎八味药材组成，药方配比为10∶6∶6∶9∶9∶6∶3∶9，所用药材均由上海中医药大学药学院张宏教授提供和鉴定。NeuN抗体(批号：ab177487)、NF-κB p65抗体(批号：ab207297)(美国Abcam公司)；IKK-β抗体(美国CST公司，批号：8943)；CD11b抗体(批号：GB15058)、TUNEL染液(批号：G1507)(武汉赛维尔生物科技有限公司)；尼氏(Nissl)染液(批号：G3245)、LFB染液(批号：G1202)(北京索莱宝技术有限公司)；ECL发光液(美国Biosharp公司，批号：BL520A)。

1.3仪器

Morris水迷宫(上海奥尔科特生物科技有限公司)；组织脱水机、包埋机(武汉俊杰电子有限公司)；倒置生物显微镜(日本尼康)；病理切片机(上海俫卡仪器有限公司)；免疫组化笔(武汉赛维尔生物科技有限公司)；化学发光成像系统(上海勤翔科学仪器有限公司)。

2、方法

2.1提取方法

用8倍体积量的75%乙醇回流提取中药材2次，每次提取时间为1.5 h。提取液经四层纱布过滤后，在旋转蒸发器中浓缩，然后在冷冻干燥机料盘中-50℃预冻5 h，真空干燥[2]。最后将温度固定在-40℃，保持72 h，制成冻干粉，保存在-80℃冰箱中待用。

2.2分组与模型制备

采用BCAS方法制作慢性脑缺血小鼠模型[3-4]。术前禁食12 h，禁水4 h。小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉后，剃除颈部毛发，仰卧位固定，用手术剪沿颈部矢状正中线剪开1 cm纵向切口，逐层钝性分离颈部组织，以显露并分离颈总动脉和迷走神经，将两条4-0缝合线绕过颈总动脉，取微弹簧(线圈内径0.18 mm，无锡萨密你弹簧有限公司)缠绕在双侧颈总动脉上，将小鼠颈部组织归位，缝合颈部切口。

共造模45只慢性脑缺血模型小鼠，10只假手术组(Sham组)小鼠未进行微弹簧套扎。实验小鼠术后正常饲养1个月，其间慢性脑缺血模型小鼠死亡3只，并剔除2只状态不佳的小鼠。余下30只模型小鼠随机分组：银杏叶提取物组(GBE组，30 mg·kg-1)，鳖甲软脉汤低剂量治疗组(BJRMT-L组，3.78 g·kg-1)，鳖甲软脉汤高剂量治疗组(BJRMT-H组，14.9 g·kg-1)，每组10只。分组后开始给药处理，GBE组小鼠灌胃给予银杏叶提取物，BJRMT组小鼠灌胃给予相应剂量鳖甲软脉汤，Sham组、模型(CCH)组小鼠灌胃给予等量生理盐水，所有小鼠连续给药12周。

2.3 Morris水迷宫测试

在第6周和第12周的给药后，对存活的小鼠进行Morris水迷宫实验，评估它们的学习和记忆能力。整个实验包括定位航行阶段和空间探索阶段。在定位航行阶段中，每日将小鼠面向池壁放入圆形水池的不同象限游泳，记录小鼠入水后成功找到平台所需的时间即为逃避潜伏期。小鼠找到平台后或者始终找不到平台，则将其引导至平台休息10 s再进行下一次实验，每只小鼠每日训练3次，每进行一次训练休息1 min，连续训练5 d。每日实验结束后用毛巾将小鼠擦干后，放在白炽灯下烤5 min再放回笼内。在第6日空间探索阶段，将小鼠面向池壁释放到起始平台对面的象限，小鼠自由探索空间，通过Morris水迷宫自动监视处理系统记录穿过平台的小鼠次数和停留在目标象限的时间百分比，停留在目标象限的时间百分比(%)=停留在目标象限的时间/潜伏期时间×100%。

2.4新物体识别实验

啮齿类动物很容易被新物体吸引并表现出较为强烈的探索偏好，因此新物体识别实验常被用于评估小鼠的记忆能力。

在第6周和第12周给药后，对存活的小鼠进行新物体识别实验以检测其学习记忆能力，分为适应、熟悉和测试3个阶段。适应阶段：实验前3日将小鼠放入箱子(长宽高均为50 cm)熟悉10 min后再取出，让小鼠适应箱子环境。熟悉阶段：实验第4日在箱内两端对称处放置两个完全相同的木方块(旧物体，3 cm×3 cm×1 cm)，两木块距箱壁及箱中心处距离均为1 cm，将小鼠放入箱内与两方木块等距的位置，等待小鼠自由探索10 min。测试阶段：将其中一个木方块换成木三角块(新物体，3 cm×2 cm×1 cm)，分别记录小鼠在10 min内对木三角块和木方块的探索时间，计算新物体识别指数。

新物体识别指数(%)=探索木三角块时间/(探索木三角块时间+探索木方块时间)×100%。

2.5 LFB染色

小鼠完成行为学实验后，腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，取出脑组织在4%多聚甲醛中浸泡固定24 h，经过蒸馏水清洗2 h，依次在70%～100%的乙醇、二甲苯和石蜡中脱水、透明和浸蜡，随后进行常规石蜡包埋、切片和干燥。切片在二甲苯中脱蜡15 min，通过乙醇梯度水化，用蒸馏水清洗，将切片浸入LFB染液中染色，并用95%乙醇处理过量染液。染色后的切片用蒸馏水清洗，并用碳酸锂溶液处理20 s后开始分化，直至背景呈浅蓝色。最后，切片通过乙醇逆梯度脱水，二甲苯透明处理后封片，在显微镜下观察胼胝体髓鞘的情况。

2.6尼氏染色

尼氏染色的制片、脱蜡和水化过程与LFB染色相同。在完成水化步骤后，将切片置于尼氏染色液中染色10 min，使用磷酸盐缓冲液(PBS)洗去未结合的染料，通过70%～100%的乙醇进行逆梯度脱水，在二甲苯中透明化处理后，封片并在显微镜下观察细胞尼氏小体的形态。

2.7 NeuN染色

NeuN染液可以与神经元核的抗原特异性结合，因此通过NeuN染色可以分析脑组织神经元的情况。NeuN染色的制片、脱蜡和水化过程与LFB染色相同。在完成水化步骤后，将切片置于柠檬酸溶液中，通过微波处理以暴露抗原。随后，使用PBS洗涤切片，在3%过氧化氢溶液中室温孵育20 min，PBS洗涤，滴加封闭液覆盖组织，室温孵育30 min，滴加NeuN抗体4℃过夜孵育。然后，用PBS洗涤切片，滴加二抗，室温下孵育1 h，用PBS洗涤后，滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，室温孵育1 h，用二氨基联苯胺进行显色，直至切片上出现棕黄色颗粒，经过苏木素复染、纯水洗涤、分化液分化、氨水返蓝和纯水冲洗，封片后，在显微镜下观察神经元细胞的分布情况。

2.8 TUNEL染色

凋亡细胞的细胞核DNA断裂会暴露出3'-OH末端，TUNEL染色可检测3'-OH末端的存在，从而评估细胞凋亡情况。TUNEL染色的制片、脱蜡和水化过程与LFB染色相同。在完成水化步骤后，用PBS洗涤切片5 min，在柠檬酸溶液中处理15 min以促进抗原的暴露。随后，使用PBS洗涤切片，在室温下使用3%过氧化氢溶液孵育20 min，加入TUNEL反应混合液，37℃孵育1 h，用PBS洗涤3次，加入辣根过氧化物酶反应液，在37℃下孵育30 min，用二氨基联苯胺进行显色，直至观察到棕黄色颗粒。显色完成后，切片经过苏木素复染、纯水洗涤、分化液分化、纯水洗涤、氨水返蓝和纯水冲洗，在二甲苯中透明化并封片，在显微镜下观察凋亡细胞的分布情况。

2.9组织免疫荧光

完成行为学测试后，受试小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，取脑组织，进行常规的脱水、硬化、透明、包埋和浸蜡处理。切片后，进行脱蜡和乙醇梯度水化处理，使用双蒸水和PBS进行洗涤。切片随后被置于柠檬酸缓冲液中，微波修复抗原，用PBS洗涤3次以去除未结合的抗体，滴加封闭液，室温封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，用PBS洗涤后加入相应的二抗。封片后利用显微镜观察并拍摄图像。

2.10蛋白免疫印迹检测

完成行为学测试后，受试小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，取脑组织，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，经研磨后使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。样品蛋白变性后，SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，转至PVDF膜上，脱脂牛奶封闭2 h，一抗4℃孵育过夜，洗涤后室温孵育二抗，采用ECL发光液进行化学发光。

2.11数据统计分析

研究采用GraphPad Prism 8.2.4软件对所得数据进行统计学分析。样本数据为计量资料，使用表示。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行组间比较，P<0.05表示差异有统计学意义。

3、结果

3.1鳖甲软脉汤对慢性脑缺血小鼠学习和记忆能力的影响

分别在小鼠给药的第6周(n=8)和第12周(n=6)，采用Morris水迷宫实验评估每组小鼠的学习和记忆能力。结果如图1A～1D所示，CCH组小鼠相较于Sham组小鼠在目标象限的活动时间和跨越平台次数显著减少(P<0.05)。给药6周后，鳖甲软脉汤高剂量组小鼠平台穿越次数显著增加(P<0.05)；给药12周后，鳖甲软脉汤高剂量组小鼠目标象限的活动时间百分比和平台穿越次数显著增加(P<0.05)。

在给药的第6周(n=8)和第12周(n=6)，分别对小鼠进行新物体识别实验测试。如图1E所示，给药6周后，CCH组小鼠与Sham组小鼠相比新物体识别指数显著降低(P<0.01)，经过鳖甲软脉汤治疗后，新物体识别指数显著增加(P<0.01)。如图1F所示，给药12周后，CCH组小鼠与Sham组小鼠相比新物体识别指数显著降低(P<0.05)；与CCH组相比，鳖甲软脉汤高剂量组新物体识别指数显著增加(P<0.05)。以上结果提示，鳖甲软脉汤可以改善慢性脑缺血小鼠的学习和记忆能力。

3.2鳖甲软脉汤减轻慢性脑缺血小鼠的病理损伤

采用NeuN染色、TUNEL染色和尼氏染色检测小鼠脑组织的病理损伤情况，结果见图2及图3。Sham组海马NeuN阳性细胞较多，细胞多层且紧密排列，CCH组小鼠海马NeuN阳性细胞明显减少(P<0.01)，结构松散。经过银杏叶提取物和鳖甲软脉汤高剂量治疗后NeuN阳性细胞增加(P<0.05)，提示海马神经元损伤的情况得到了改善。Sham组皮层细胞的TUNEL阳性细胞数较少，CCH组小鼠相较于Sham组小鼠皮层TUNEL阳性细胞显著增多(P<0.01)，表明皮层有大量神经元凋亡，经过银杏叶提取物和鳖甲软脉汤治疗后TUNEL阳性细胞减少(P<0.05，P<0.01)，神经元损伤的情况得到了改善。

Sham组小鼠的海马神经元尼氏阳性细胞数量较多，尼氏小体着色深，细胞核完整，而CCH组小鼠海马神经元尼氏阳性细胞数明显减少(P<0.01)，结构松散且细胞核固缩，尼氏小体色浅，鳖甲软脉汤高剂量组小鼠相较于CCH组小鼠海马神经元尼氏阳性细胞数明显增加(P<0.05)。LFB染色常用于检测髓鞘结构形态及轴突纤维密度。本实验采用LFB染色检测小鼠脑组织胼胝体神经元髓鞘病理损伤情况，以评估鳖甲软脉汤对慢性脑缺血小鼠脑白质胼胝体病理损伤的治疗作用。实验结果显示，Sham组小鼠胼胝体髓鞘结构致密，着色较深；CCH组小鼠胼胝体髓鞘着色较浅，结构松散，部分髓鞘空泡化。经鳖甲软脉汤和银杏叶提取物治疗后，髓鞘病理损伤减轻，染色加深，髓鞘空泡化现象减少，以上结果表明鳖甲软脉汤能减轻慢性脑缺血小鼠脑组织的髓鞘损伤(见图3)。

3.3鳖甲软脉汤抑制慢性脑缺血小鼠脑组织中NF-κB途径

CD11b是小胶质细胞的标志物，在小胶质细胞激活过程中表达增加。免疫荧光实验结果如图4A显示，Sham组小鼠脑组织皮层区域CD11b阳性细胞较少，说明基本无小胶质细胞聚集。与CCH组相比，鳖甲软脉汤低剂量组小鼠脑组织小胶质细胞NF-κB p65表达减少(P<0.05)；高剂量组小鼠脑组织小胶质细胞CD11b、NF-κB p65表达减少(P<0.05，P<0.01)。

图1鳖甲软脉汤对慢性脑缺血小鼠学习和记忆能力的影响

进一步采用免疫印迹方法对小鼠脑组织中NF-κB信号通路相关蛋白的表达进行检测。如图5所示，CCH组相较于Sham组，NF-κB p65和IKK-β蛋白表达水平上调(P<0.01)，而经过银杏叶提取物、鳖甲软脉汤高剂量的处理后，NF-κB p65和IKK-β蛋白表达水平下调(P<0.05，P<0.01)。上述结果表明鳖甲软脉汤能抑制慢性脑缺血小鼠脑组织中NF-κB信号通路。

4、讨论与结论

慢性脑缺血指大脑长期血流量不足，其典型临床表现包括头昏、乏力、记忆力减退以及认知功能障碍等症状[5]。研究表明，慢性脑缺血的病理生理机制涉及皮质和海马区神经元丢失、脑白质病变(WML)、免疫炎症损伤、血管内皮功能障碍、氧化应激损伤和细胞凋亡等[6-7]。在慢性脑缺血发生时，大脑处于持续缺氧状态，脑内的免疫细胞如小胶质细胞和星形胶质细胞会快速反应并激活MAPK和NF-κB等免疫相关信号通路，产生大量炎症介质，导致血管内皮细胞功能障碍和脑血流微循环受阻。这些炎症介质还会促进免疫炎症恶性循环和内皮细胞功能障碍，进一步加重WML和认知功能障碍[8-9]。这一点在慢性脑缺血动物模型中也有表现，例如Morris水迷宫实验显示，慢性脑缺血大鼠的逃避潜伏期和游泳路径均明显延长[10-11]。此外，慢性脑缺血还会导致基底前脑胆碱能神经系统损伤，从而在整体水平出现学习记忆障碍[12]。

图2 NeuN染色和TUNEL染色检测小鼠脑组织的病理损伤情况

图3尼氏染色和LFB染色检测小鼠脑组织的病理损伤情况

鳖甲软脉汤经过多年的临床应用，已被证实对小血管疾病有良好的治疗效果[2]。给药第6周和第12周均进行了水迷宫实验和新物体识别实验，实验结果显示，经过鳖甲软脉汤治疗的慢性脑缺血小鼠有更好学习记忆能力，后续的病理学实验进一步验证了鳖甲软脉汤对慢性脑缺血小鼠的治疗作用。LFB染色实验结果显示慢性脑缺血小鼠胼胝体髓鞘结构松散甚至有部分髓鞘出现部分空泡化的现象，表明长时间的脑低灌注导致了慢性脑缺血小鼠胼胝体髓鞘的损伤。经鳖甲软脉汤治疗后，髓鞘病理损伤减轻，髓鞘空泡化现象减少。尼氏染色、NeuN染色和TUNEL染色的病理染色结果显示，慢性脑缺血小鼠皮层和海马神经元都出现了大量神经元凋亡的情况，而经过鳖甲软脉汤的治疗后，慢性脑缺血小鼠的神经元损伤的情况得到了改善。以上结果都验证了鳖甲软脉汤对慢性脑缺血导致的髓鞘损伤和神经元凋亡有改善作用。

小胶质细胞作为中枢神经系统的常驻免疫细胞，在大脑受到损伤时会迅速动员激活，是大脑神经炎症发生的标志。在采用BCAS手术建立的小鼠模型研究中发现，小鼠持续的脑低灌注导致脑内炎症反应活跃，小胶质细胞激活加重脑白质损伤，进一步加重认知功能损伤。NF-κB信号通路作为经典的核心炎症通路，已经被证实可以介导小胶质细胞激活极化的作用，同时小胶质细胞激活极化在慢性脑缺血的发生发展过程中也有着多重的作用。因此，本研究探讨了鳖甲软脉汤对NF-κB信号通路的影响。免疫荧光和免疫印迹实验结果表明，鳖甲软脉汤治疗能显著降低慢性脑缺血小鼠脑组织中NF-κB p65和IKK-β的表达水平。所以，鳖甲软脉汤有可能通过抑制NF-κB信号通路发挥神经保护作用，这为鳖甲软脉汤治疗慢性脑缺血提供了一种可能的分子机制。

图4鳖甲软脉汤对慢性脑缺血小鼠脑组织中NF-κB表达的影响

图5鳖甲软脉汤对慢性脑缺血小鼠脑组织中NF-κB蛋白表达的影响

值得注意的是，鳖甲软脉汤多成分的协同作用可能是其发挥疗效的关键[13-15]。鳖甲软脉汤中的药材如鳖甲、垂盆草、石菖蒲等均具有清热解毒、益气活血等功效，鳖甲软脉汤中的许多化合物或成分已被发现与慢性脑缺血的治疗有关。例如，已知的天然类黄酮类化合物槲皮素可清除自由基，介导小胶质细胞向抗炎表型的转变，并减少海马区促炎症因子的产生，减轻脑白质损伤[16]。木犀草素可通过调节PI3K/Akt信号通路减轻慢性脑缺血诱导的大鼠认知功能障碍[17]。这些成分可能通过不同的途径共同发挥神经保护和抗炎作用。然而，鳖甲软脉汤的具体成分如何相互作用以及各自的贡献仍需进一步的研究。

综上所述，本研究表明鳖甲软脉汤对慢性脑缺血小鼠学习和记忆障碍具有显著改善作用，并初步揭示了其通过NF-κB信号通路发挥神经保护作用的潜在机制。这些发现为治疗慢性脑缺血相关认知功能障碍方面的应用提供了科学依据，并为未来的临床研究和药物开发提供了参考。

参考文献:

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[5]穆浩月,鞠奕,赵性泉.慢性脑缺血病理生理机制与临床表现的研究进展[J].中国医学前沿杂志(电子版),2021,13(4):21-25.

[10]赵玲,刘丽,李雅莉,等.慢性脑低灌注状态对大鼠学习记忆功能及脑组织自由基代谢的影响[J].中国行为医学科学,2005,14(11):7-9.

[12]李永生,陈皓,王玉宾,等.慢性低灌注对大鼠基底前脑胆碱能系统及认知功能的影响[J].实用医药杂志,2006,23(4):443-446.

[13]王岩玲,任明,张翔宇,等.慢性脑缺血证候分布和辨证用药规律的文献研究[J].中国中医基础医学杂志,2022,28(3):394-397.

基金资助:上海市浦东新区卫生系统学科建设项目-新兴､交叉学科(No.PWXx2020-03);上海市浦东新区卫生系统学科建设项目-重点专科(No.PWZzk 2022-08);

文章来源:郭羽晨,邓珊珊,高原,等.鳖甲软脉汤改善慢性脑缺血小鼠学习和记忆障碍的作用研究[J].中南药学,2024,22(12):3245-3252.