帕金森病（Parkinson's disease,PD）是一种常见的神经退行性疾病，临床主要表现为运动迟缓、肌肉强直、姿势和步态不稳定、运动功能障碍及静止性震颤[1]。此外，新近研究指出PD患者还具有认知障碍、情绪改变等非运动性症状[2]。因此PD对患者造成严重的身体及心理损害。PD伴随有神经元α-突触核蛋白积累、多巴胺能神经元缺陷等神经病理学特征，然而其具体机制仍不明确。

细胞因子信号抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3）是SOCS蛋白家族的主要成员，参与抑制细胞内白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6）介导的炎症信号转导。神经退行性疾病多伴随有SOCS3表达下调，而激活SOCS3可阻断IL-6介导的炎症信号通路，从而改善神经退行性病变[3-5]。SOCS3在PD中发挥至关重要的调控作用。新近研究证实SOCS3在PD大鼠模型中表达下调，并发现激活SOCS3导致HMGB1/RAG/NF-B通路活性降低，从而抑制PD大鼠的神经炎症，改善多巴胺耗竭及运动障碍等PD样症状[6]。由此可见，SOCS3失活是促进PD发生、发展的重要因素，理清导致SOCS3失活的原因对PD干预及治疗至关重要。

N6-腺苷甲基化修饰（N6-Methyladenosine,m6A）修饰是最常见的RNA修饰方式，在RNA剪接、翻译、稳定性、易位中发挥重要的调控作用。在m6A过程中，类甲基化转移酶3(methyltransferaselike 3,METTL3）是首个被发现的甲基化转移酶，介导细胞内目标RNA的甲基化连接。SOCS3的表达受METTL3介导的m6A修饰调控。新近研究指出，METTL3与SOCS3 mRNA上的m6A位点结合，增强了SOCS3 mRNA稳定性，进而导致SOCS3表达上调[7]。由此可见，SOCS3表达受METTL3正向调控，METTL3表达异常也可能对SOCS3表达产生同向影响。曾有证据指出METTL3在PD小鼠模型中表达下调[8]。因此，METTL3下调可能影响SOCS3表达，从而促进PD发病机制。

乳酸化是一种新发现的翻译后修饰，可参与调控蛋白质功能和疾病发生。在乳酸化机制中，组蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase 2,HDAC2）负责组蛋白的去乳酸化修饰[9]。HDAC2下调可能引起靶标的乳酸化水平升高，继而影响靶标表达水平。HDAC2在PD患者的大脑黑质组织中表达上调[10]，而抑制HDAC2活性有助于抑制PD诱导的神经元细胞死亡[11]，提示HDAC2在PD发病机制中起重要的调控作用。对METTL3而言，HDAC2可能通过去乳酸化作用调控METTL3表达。有研究证实，METTL3的组蛋白上携带乳酸化修饰，促进METTL3表达上调[12]。鉴于此，本研究推测HDAC2可能通过促进METTL3组蛋白去乳酸化导致METTL3表达下调，从而引起下游基因的m6A修饰失调。

目前，尚无研究证实HDAC2通过METTL3抑制SOCS3表达促进PD中神经元细胞死亡的作用机制。因此，本研究拟制备PD体外神经元细胞模型，旨在阐明HDAC2/METTL3/SOCS3轴对PD神经元细胞死亡的调控机制，为PD干预及治疗提供可能靶点。

1、材料与方法

1.1材料与试剂

SH-SY5Y细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司），Calcein/PI染色试剂盒（C2015S，上海碧云天生物技术有限公司），MTT检测试剂盒，SDS-PAGE一步法凝胶配制试剂盒（P0901，上海碧云天生物技术有限公司），一步法逆转录-荧光定量PCR试剂盒[FP313，天根生化科技（北京）有限公司]，细胞裂解液（P0013C，上海碧云天生物技术有限公司），Western blotting封闭液（P0023B，上海碧云天生物技术有限公司），10X TBST缓冲液（T1081，北京索莱宝科技有限公司），10X PBS溶液（P1022，北京索莱宝科技有限公司），放线菌素D(HY-17559，美国MedChemExpress生物科技公司，纯度99.04%),meRIP-qPCR试剂盒（Bes5203，广州伯信生物科技有限公司），RIP-PCR试剂盒（KT102-01，广州赛诚生物科技有限公司），ChIP-PCR试剂盒（Bes5104，广州伯信生物科技有限公司），METTL3抗体[ab195352,1∶1 000，艾博抗（上海）贸易有限公司]，组蛋白H3赖氨酸18乳酸化（histone h3 lysine 18 lactylation,H3K181a）抗体（PTM-1406RM,1∶1 000，美国PTM BIO公司），Pan-Kla抗体（A18831,1∶1 000，武汉爱博泰克生物科技有限公司），Histon H3抗体[ab176840,1∶1 000，艾博抗（上海）贸易有限公司]，β-actin抗体[ab8227,1∶1 000：艾博抗（上海）贸易有限公司]，TRIzol试剂（R0016，上海碧云天生物技术有限公司），HDAC2抑制剂（HY-151248，美国Med Chem Express生物科技公司），1-甲基-4-苯基吡啶离子（1-methyl-4-phenylpyridiniumion,MPP+)(HY-W008719，美国MedChemExpress生物科技公司），HRP交联的2抗（7074，美国Cell signaling technolgy公司，稀释度1∶1 000),Lipofectamine 3000试剂盒（美国赛默飞世尔科技公司）。

1.2实验方法

1.2.1 RNA干扰载体及过表达载体

从NCBI数据库获取METTL3序列基因，基于RNA干扰技术设计并合成METTL3 shRNA(sh-METTL3）及阴性对照shRNA(sh-NC）。以pcDNA3.1为骨架，构建METTL3过表达载体（oe-METTL3）及阴性对照（oe-NC）。

1.2.2细胞培养及药物处理

采用含10%胎牛血清及1%链青霉素的高糖DEME培养基孵育细胞，37℃、5%二氧化碳CO2条件下培养。待细胞生长状况良好后进行药物处理。MPP+诱导：向细胞培养基中加入MPP+试剂，最终浓度为50μmol/L,37℃、5%CO2下孵育24 h。HDAC2抑制剂：细胞接受MPP+诱导前，加入10μmol/L HDAC2-IN-7(HDAC2抑制剂）处理48 h。sh-NC、sh-METTL3、oe-NC及oeMETTL3组处理：结合Lipofectamine 3000试剂盒将sh-NC、sh-METTL3、oe-NC、oe-METTL3转染至细胞，转染48 h后细胞还需进行MPP+诱导及抑制剂处理。

1.2.3活死细胞染色检测细胞死亡（Calcein/PI染色）

取96孔板，每孔接种5 000个细胞，贴壁后进行分组实验。随后采用Calcein/PI染色试剂盒行活死细胞染色。通过荧光显微镜检测观察细胞染色情况，其中Calcein AM标记活细胞，发绿光，Ex/Em=494/517 nm,PI标记死细胞，发红光，Ex/Em=535/617 nm。

1.2.4 MTT法检测细胞活性

取96孔板，每孔培养5 000个细胞以进行分组实验。实验后每孔加入10μL MTT检测工作液，37℃下继续孵育1 h。采用酶标仪检测样品490 nm处的光密度（optical density,OD），计算细胞活性。

1.2.5实时荧光定量聚合酶链反应（real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）

本研究通过qRT-PCR定量HDAC2、SOCS3、METTL3表达。取实验处理过的细胞样品，加入1 mL TRIzol试剂以提取细胞总RNA。采用一步法逆转录荧光定量PCR试剂盒及荧光定量PCR仪将总RNA逆转录为cDNA并进行荧光定量，获取Ct值。以GAPDH为内参基因，用2-ΔΔCt法计算HDAC2、SOCS3、METTL3目的基因的相对表达量。qRT-PCR反应条件：50℃逆转录15 min;95℃预变性2 min;95℃变性15 s,60℃退火/延伸30 s，重复变性和退火/延伸步骤，共40个循环；熔解曲线分析。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.6 Western blotting检测METTL3、H3K18la、Pan-Kla蛋白相对表达量

移除细胞培养基，加入细胞裂解液，冰上裂解，至细胞充分裂解后4℃、12 000 r/min离心5 min，取上清液用于后续Western blotting检测METTL3、H3K18la、Pan-Kla蛋白。H3K18la以Histon H3为内参，其余蛋白均以β-actin为内参，计算各蛋白的相对表达量。

1.2.7 ChIP-qPCR检测METTL3在H3K18la上的富集程度

取细胞样品，经多聚甲醛固定、甘氨酸孵育、胞核沉淀、超声破碎后，结合H3K18la抗体及ChIP-PCR试剂盒进行免疫沉淀，获取并分离蛋白质-DNA复合物。解交联、DNA纯化后采用荧光定量PCR技术定量METTL3表达水平。

1.2.8 meRIP-qPCR检测SOCS3 m6A表达

采用TRIzol试剂提取细胞总RNA。向RNA样品中加入450 mL IP缓冲液2及2μL RNA酶抑制剂，超声破碎15～30次，通过琼脂凝胶电泳检测RNA片段大小并回收。取50μL RNA样品作为Input组，其余样品为IP组。向IP组样品中加入20μL IP缓冲液2、4μg m6A抗体或IgG抗体，4℃下于垂直孵育器中孵育4 h。向IP组样品中加入接肢体蛋白A/G磁珠，4℃下于垂直孵育器中孵育1 h，收集磁珠，洗涤缓冲液洗涤3次后通过酚氯仿法抽提RNA，结合荧光定量PCR法检测SOCS3 m6A表达。

1.2.9放线菌素D检测SOCS3 mRNA稳定性

取6孔板，分别设置孔1、2、3、4、5、6，每孔接种30 000个细胞，贴壁后给予相应的实验处理。实验后，向孔1加入10μg/mL放线菌素D试剂，并通过qRT-PCR检测SOCS3 mRNA相对表达量。随后，依次在1、2、4、6、8 h取出孔2、3、4、5、6的细胞样品加入10μg/mL放线菌素D试剂，并通过q RT-PCR检测SOCS3 mRNA相对表达量。计算SOCS3 mRNA的半衰期。

1.2.10 RIP-PCR检测SOCS3基因相对表达量

收集细胞，加入RIP裂解液处理细胞。取磁珠，使用RIP洗涤缓冲液洗涤后离心，并加入RIP洗涤缓冲液重悬磁珠。将磁珠悬浮液与METTL3抗体或IgG抗体混匀，孵育结束后收集磁珠。取RNA细胞样品，离心后收集RNA样品，并与磁珠-抗体复合物混匀，4℃孵育过夜后收集磁珠，与蛋白酶K溶液混匀并孵育。经RNA抽提及纯化后对RNA进行RIP--PCR检测，确定SOCS3基因相对表达量。

1.3统计学方法

数据分析采用SPSS 23.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较用独立样本t检验，3组间比较用单因素方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验；不同时间点的比较采用重复测量设计的方差分析；使用Excel拟合工具对SOCS3变化曲线行非线性拟合。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 MPP+组与Control组HDAC2基因相对表达量的比较

MPP+组与Control组HDAC2基因相对表达量比较，经t检验，差异有统计学意义（P<0.05);MPP+组HDAC2基因相对表达量高于Control组。两组HDAC2蛋白相对表达量比较，经t检验，差异有统计学意义（P<0.05);MPP+组HADC2蛋白相对表达量高于Control组。见表2和图1。

表2 两组HDAC2基因和蛋白相对表达量的比较

图1 HDAC2蛋白表达

2.2 Control组、MPP+组、MPP++HDAC2抑制剂组细胞死亡率及细胞活性的比较

Control组、MPP+组、MPP++HDAC2抑制剂组细胞死亡率比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）。MPP+组细胞死亡率高于Control组（P<0.05),MPP++HDAC2抑制剂组细胞死亡率低于MPP+组（P<0.05）。见表3和图2。

Control组、MPP+组、MPP++HDAC2抑制剂组细胞活性比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）。MPP+组细胞活性低于Control组（P<0.05),MPP++HDAC2抑制剂细胞活性高于MPP+组（P<0.05）。见表3。

表3 各组细胞死亡率和细胞活性的比较

2.3 Control组、MPP+组、MPP++HDAC2抑制剂组的METTL3乳酸化水平的比较

Control组、MPP+组、MPP++HDAC2抑制剂组的METTL3的乳酸化水平比较（通过METTL3基因上的H3K18la水平评估METTL3的乳酸水平，IgG抗体为ChIP实验的阴性对照），经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）。MPP+组低于Control组（P<0.05),MPP++HDAC2抑制剂组高于MPP+组（P<0.05）。各组METTL3及H3K18la蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P<0.05）。Control组METTL3及H3K18la蛋白相对表达量均低于Control组（P<0.05),MPP++HDAC2抑制剂组METTL3及H3K18la蛋白相对表达量均高于与MPP+组（P<0.05）。见图3和表4、5。

2.4 Control组、MPP+组、MPP++HDAC2抑制剂组SOCS3基因和蛋白相对表达量的比较

Control组、MPP+组、MPP++HDAC2抑制剂组的SOCS3基因相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）。MPP+组低于Control组（P<0.05),MPP++HDAC2抑制剂组高于MPP+组（P<0.05）。各组SOCS3蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）。MPP+组低于Control组（P<0.05);MPP++HDAC2抑制剂组高于MPP+组（P<0.05）。见图4和表6。

2.5 oe-NC组与oe-METTL3组SOCS3富集度的比较

oe-NC组与oe-METTL3组SOCS3富集度比较，经t检验，差异有统计学意义（P<0.05);oe-METTL3组SOCS3富集度高于oe-NC组（P<0.05）。见表7。

2.6 oe-NC组与oe-METTL3组SOCS3基因相对表达量的比较

oe-NC组与oe-METTL3组METTL3和SOCS3基因相对表达量比较，经t检验，差异均有统计学意义（P<0.05);oe-METTL3组METTL3和SOCS3基因表达量均高于oe-NC组。见表8。

图2 活死细胞染色检测细胞死亡率

图3 METTL3及H3K18la蛋白表达

表4 各组METTL3的乳酸化水平比较

表5 各组METTL3、H3K18la蛋白相对表达量比较

图4 SOCS3蛋白表达

oe-NC组与oe-METTL3组不同时间点SOCS3基因相对表达量比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：(1)不同时间SOCS3基因相对表达量比较，差异有统计学意义（F=38.130,P=0.000);(2)oe-NC组与oe-METTL3组SOCS3基因相对表达量比较，差异有统计学意义（F=20.150,P=0.011),oe-METTL3组高于oe-NC组；(3)oe-NC组与oe-METTL3组SOCS3基因相对表达量随时间变化趋势比较，差异有统计学意义（F=8.945,P=0.000）（见表9）。对两组的SOCS3表达量变化曲线行非线性拟合，结果表明，SOCS3 mRNA半衰期为t=1.32 h,oe-METTL3组SOCS3 mRNA半衰期为t=1.49 h。

表6 各组SOCS3基因和蛋白相对表达量比较

表7 两组SOCS3富集度比较

表8 两组METTL3及SOCS3基因相对表达量比较

2.7敲低METTL3逆转HDAC2抑制剂的神经保护作用

MPP++HDAC2抑制剂组、MPP++HDAC2抑制剂+sh-NC组、MPP++HDAC2抑制剂+sh-METTL3组细胞死亡率及细胞活性比较，经方差分析，差异均有统计学意义（均P<0.05）。MPP++HDAC2抑制剂+sh-METTL3组细胞死亡率高于MPP++HDAC2抑制剂+sh-NC组（P<0.05），细胞活性低于MPP++HDAC2抑制剂+sh-NC组（P<0.05）。见图5和表10。

表9 放线菌素D实验验证SOCS3 mRNA稳定性

图5 活死细胞染色检测细胞死亡率（标尺：20μm)

表1 0 各组细胞死亡率及细胞活性比较

2.8敲低METTL3逆转HDAC2抑制剂对METTL3及SOCS3的调控作用

MPP++HDAC2抑制剂组、MPP++HDAC2抑制剂+sh-NC组、MPP++HDAC2抑制剂+sh-METTL3组的METTL3和SOCS3基因相对表达量比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P<0.05）。MPP++HDAC2抑制剂+sh-METTL3组METTL3及SOCS3基因相对表达量均低于MPP++HDAC2抑制剂+sh-NC组（均P<0.05）。见表11。

MPP++HDAC2抑制剂组、MPP++HDAC2抑制剂+sh-NC组、MPP++HDAC2抑制剂+sh-METTL3组的METTL3和SOCS3蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P<0.05）。MPP++HDAC2抑制剂+sh-METTL3组METTL3和SOCS3蛋白相对表达量低于MPP++HDAC2抑制剂+sh-NC组（P<0.05）。见图6和表12。

表1 1 各组METTL3、SOCS3基因相对表达量比较

图6 METTL3及SOCS3的蛋白表达

表1 2 各组METTL3及SOCS3蛋白相对表达量比较

3、讨论

SOCS3对维持神经元发育和成长至关重要。MISHRA等[13]研究表明，过表达SOCS3可诱导神经干细胞向神经元分化，并促进神经元细胞的存活与生长。PD是伴随有神经退行性病变的神经系统疾病，SOCS3表达下调与PD的神经退行及变性密切相关。PD动物及细胞模型显示，SOCS3在PD中表达下调，上调SOCS3可抑制神经毒性，从而减少神经元细胞死亡并改善PD症状[6,14]。本研究证实，经MPP+处理后的神经元细胞中SOCS3表达显著下调。由此可见，SOCS3表达下调是PD中神经元细胞的重要表现。

本研究证实在MPP+处理后的神经元细胞中抑制HDAC2可导致SOCS3表达上调，表明HDAC2与SOCS3表达密切相关。HDAC2对多巴胺能神经元变性具有重要影响。GUO等[15]认为，HDAC2可诱导PD小鼠小胶质细胞激活，从而促进神经炎症，推动PD小鼠多巴胺能神经元的进行性变性。HDAC2的异常表达可导致神经可塑性改变，进而引起神经退行性病变[16]。本研究结果同样证实，HDAC2在MPP+处理后的神经元细胞中表达升高，且抑制HDAC2可降低神经元细胞死亡率，并提高细胞活性。由此可见，HDAC2对PD发病机制至关重要。HDAC2对SOCS3表达的影响也提示了HDAC2在PD中的潜在机制，即：HDAC2可能通过促进SOCS3下调引起神经细胞死亡，进而推动PD发生。

本研究进一步发现，HDAC2可能通过METTL3调控SOCS3表达。METTL3是m6A甲基转移酶复合物的催化子单元，负责催化甲基组从供体转移至受体RNA亚基[17-20]。METTL3与SOCS3转录表达中发挥重要作用。已有证据证实，在其他细胞类型中METTL3介导SOCS3 mRNA的m6A修饰[1,21]。本研究探讨了METTL3与SOCS3在PD中的重要联系，结果证实，经MPP+处理后的神经元细胞中METTL3同样介导SOCS3的m6A修饰，这一结果也提示METTL3在PD中是调控SOCS3表达的重要因子。组蛋白乳酸化是新发现的蛋白质修饰方式，可激活靶基因的转录过程，从而促进基因表达[22-24]。METTL3表达受乳酸化的正向调控[9,25],HDAC2是乳酸化的关键调控因子，可移除目标蛋白的乳酸修饰基团，因此HDAC2影响METTL3的乳酸化修饰。本研究结果发现，MPP+处理的神经元细胞模型表现为METTL3乳酸化水平降低，HDAC2抑制剂导致METTL3乳酸化水平及表达升高，而敲低METTL3可抵消HDAC2的影响。以上结果说明，在PD中HDAC2可能通过去乳酸化抑制METTL3表达。在此基础上，本研究又进一步证实，在MPP+处理的神经元细胞中敲低METTL3可逆转HDAC2抑制剂的神经保护作用，及其对SOCS3的促表达效应，这反向说明在PD中HDAC2可能通过METTL3/SOCS3轴引起神经元细胞死亡，抑制细胞存活。

本研究结果虽然证实HDAC2/METTL3/SOCS3轴对PD中神经元细胞死亡及存活的调控机制，但未能通过PD大鼠模型验证以上机制，这是本研究的不足之处。此外SOCS3是IL-6炎症通路的关键调控因子，在神经炎症中发挥重要作用，然而本研究仅从神经元细胞死亡及存活展开研究和讨论，未能进一步探究HDAC2/METTL3/SOCS3轴对PD神经炎症的影响，这也是本研究的另一不足之处。后续研究将通过MPTP诱导法复制PD大鼠模型，在动物水平上进一步验证HDAC2/METTL3/SOCS3轴对神经元细胞死亡、存活、炎症反应的确切影响。

综上所述，本研究证实了在PD中HDAC2通过诱导METTL3组蛋白去乳酸化抑制METTL3表达，这一机制引起SOCS3的m6A修饰水平降低并导致SOCS3表达下调，进而促进PD发病。本研究为PD患者提供了可能的治疗靶点。

参考文献:

[20]邓丽娇,张纪岩.类甲基化转移酶3(METTL3)在免疫细胞和造血干细胞中的作用研究进展[J].细胞与分子免疫学杂志,2021, 37(6):557-562.

基金资助:贵州省中医药管理局中医药､民族医药科学技术研究课题(No:QZYY-2021-011); 贵州省科技厅2020年基础研究重大项目(No:黔科合基础[2020]1Z059);

文章来源:刘韵,冯丹,刘纷纷,等.组蛋白去乙酰化酶2在帕金森病中的作用及机制研究[J].中国现代医学杂志,2024,34(21):43-51.