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黑质炎症小体NLRP3信号通路探讨芍地帕宁方调控帕金森病小鼠疼痛

2024-11-12 103 上传者：管理员

摘要：目的观察芍地帕宁方对诱导的亚急性帕金森病(PD)1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的亚急性帕金森病(PD)模型小鼠痛阈的变化，并分析可能的机制。方法将21只雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组、模型组与帕宁组。对照组注射等体积生理盐水，其余各组均予腹腔注射MPTP(30 mg/kg),连续5 d,制备亚急性PD小鼠模型。造模成功后，帕宁组按生药40.5 g/kg给予芍地帕宁方药液灌胃处理，1次/d,连用2 w;模型组予以等体积生理盐水，1次/d,连用2 w。采用电子测痛仪、足底热刺痛仪检测小鼠机械痛阈和热痛阈，爬杆、悬挂试验检测小鼠运动行为学变化；Western印迹法检测黑质NOD样受体蛋白(NLRP)3、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α炎症因子蛋白的表达；免疫组织化学法检测黑质酪氨酸羟化酶(TH)表达。结果与对照组比较，模型组爬杆时间明显延长、悬挂评分明显降低、机械痛阈值、热痛阈明显降低(P<0.01),NLRP3、IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达明显升高(P<0.01),黑质内TH表达明显降低(P<0.01);与模型组比较，帕宁方组爬杆时间明显缩短(P<0.01),悬挂评分、机械痛阈值、热痛阈明显增加(P<0.05);NLRP3、IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达明显降低(P<0.01),黑质TH阳性细胞表达明显增多(P<0.01)。结论芍地帕宁方可改善PD小鼠疼痛，其作用机制可能与其抑制黑质NLRP3炎症小体表达，减少炎症因子的释放而提高黑质多巴胺神经元表达有关。

关键词：
1-甲基-4-苯基-1
2
3
6-四氢吡啶(MPTP)
NOD样受体蛋白(NLRP)3
帕金森病
炎症因子
疼痛
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帕金森病(PD)是第二常见的神经退行性疾病，全球患病率超过逐年增长[1],通常表现为运动症状和非运动症状，其非运动症状最早可能在诊断运动症10年或更长的时间出现[2],包括疼痛、自主神经功能障碍、认知/精神障碍和睡眠异常，这些往往比运动症状更加复杂。疼痛是最常见的非运动性症状之一，影响了68%～95%的PD患者，PD患者疼痛的病因、表型和机制均是复杂的，是基于疼痛强度、症状复杂性、疼痛病理生理学和合并疾病存在的复杂症状[3,4]。有研究发现中枢因素是PD疼痛的重要原因[5]。研究发现羟考酮-纳洛酮缓释片、左旋多巴/卡比多巴肠凝胶、沙芬酰胺等药物对PD相关疼痛具有的潜在功效，但在药物治疗选择仍然有限[6～8]。近年来研究发现，中医药对PD的运动症状和非运动症状的治疗效果显著，同时能够减少西药的用量及药物不良反应，延缓疾病进展[9～11]。中药在中医整体观念，辨证施治的优势基础上，具有多靶点、多环节、多途径的作用特点[12]。中医药具有易取材、成本低、安全性高、生物活性高等优点，在PD的防治方面具有优势，目前国内外针对中医药治疗PD疼痛机制探讨的研究尚少。芍地帕宁方前期临床试验已被证实可改善PD患者运动及部分非运动症状如抑郁、认知和睡眠[13],但对于PD疼痛的作用并未明确，因此，本研究将探索芍地帕宁方对MPTP诱导的亚急性PD模型小鼠痛阈的干预作用及可能的机制，为中医药PD疼痛的治疗和机制提供新的策略和科学依据。

1、材料与方法

1.1动物

21只雄性C57BL/6J小鼠，均为8周龄，且符合无特定病原体(SPF)级标准，体质量19～26 g,全部购自杭州子源实验动物科技有限公司，生产许可证号：SCXK(浙)2019-0004,动物合格证号：20221212Abzz0105000878。适应性饲养于安徽中医药大学第一附属医院动物房，饲养环境保持恒定的温度[(22±2)℃],采用12 h光照与12 h黑暗的自然昼夜交替模式，确保自由摄食饮水。本研究通过安徽中医药大学第一附属医院医学与实验动物伦理委员会审查(伦理审批号：AHUCM-mouse-2023001)。

1.2药物

芍地帕宁方(熟地15 g、白芍30 g、枸杞20 g、肉苁蓉15 g、地龙12 g、鸡血藤15 g)购自安徽中医药大学第一附属医院。所用药物(配方颗粒小包装)均购于安徽中医药大学第一附属医院中药房，各药物免煎颗粒剂加入蒸馏水配制成含生药1.63 g/ml药液，常温冷却后，5℃冰箱内保存备用，灌胃前充分摇匀。

1.3试剂与仪器

MPTP造模剂(Selleck),4%多聚甲醛(PFA),抗酪氨酸羟化酶(TH)单克隆抗体(三鹰),替拉唑，二甲苯(天津市凯通化学),柠檬酸盐修复液、磷酸盐缓冲液(PBS)、过氧化物酶封闭液、抗小鼠/兔二步法检测试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、苏木素染液、中性树胶(均为ebiogo)。电子Von Frey压力测痛仪，热痛反应潜伏期测量仪，生物组织自动脱水机、包埋机(湖北亚光),切片机、切片刀(Leica),电泳仪、电泳槽、转膜仪(Tanon),电热恒温鼓风干燥箱、隔水式恒温培养箱(上海三发),常温微量离心机(海门市其林贝尔仪器制造有限公司，LX300),高速冷冻离心机(安徽嘉文仪器装备有限公司，JW-3021HR),磁力加热搅拌器(常州市人和仪器厂，JJ-79-1),免疫组化笔、黏附载玻片(ebiogo),显微镜(OLYMPUS),自制爬杆，悬挂麻绳。

1.4实验分组与造模

小鼠适应喂养1 w后，随机分为对照组、模型组和帕宁组各7只。模型组和帕宁组每日腹腔注射30 mg/Kg MPTP,连续5 d,对照组注射等体积生理盐水。

1.5行为学测试

1.5.1爬杆试验使用一根长50 cm、直径2 cm缠有医用纱布的木杆作为实验爬杆。将装置垂直放置，小鼠头朝上轻轻放在木杆顶部，记录小鼠掉头后从杆顶到双前肢接触杆底的时间，测3次取平均值(如小鼠途中停滞或反向攀爬则重新测定)。

1.5.2悬挂实验使用自制的悬挂麻绳，将小鼠悬挂于离地约30 cm的麻绳上，观察并评分小鼠后肢抓绳情况。两后肢均抓绳计3分，一只抓绳计2分，均不抓绳计1分，重复3次取平均值。

1.6机械痛、热痛阈的测量

1.6.1机械刺激伤害感受阈

小鼠置于底部孔径为0.5 cm×0.5 cm的铁丝网玻璃箱中30 min平静后，用电子von Frey压力测痛仪测定左足底跖侧皮肤，记录抬腿或缩足的最大折力(g)。每只小鼠测定3次，间隔5 min,取平均值。

1.6.2热刺激伤害感受阈

测试前3 d,小鼠在热痛反应测量仪上适应30 min;用8 V、50 W的高强度灯泡照射小鼠两侧后足掌心，调节电压使痛反应(舔足或抬离)时间为10～12 s,最长照射时间设为20 s;记录后掌痛反应时间，每侧肢体测量3次，每次间隔至少5 min。

1.7免疫组织化学法检测小鼠黑质TH的表达

小鼠眼眶取、取出中脑黑质，4%PFA固定1 h,依次经15%、20%、30%蔗糖梯度脱水，用OCT包埋并制作连续冠状切片，在37℃烘片。用5%牛血清白蛋白(BSA)加0.5%Triton X-100 0.01 mol/L PBS封闭，室温1 h,滴加1∶500的小鼠抗TH单克隆抗体，4℃过夜。PBS冲洗后，加入1∶500荧光二抗，PBS冲洗，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染，封片。高倍镜下在黑质部位阳性神经元细胞中各组随机选取6个视野，计数并观察形态。

1.8 Western印迹法分析脑黑质组织中NLRP3炎症小体及相关炎症因子的蛋白表达情况

将小鼠脑组织的黑质部分取出并加入液氮中匀浆，直至无块状物，加入放射免疫沉淀(RIPA)细胞裂解液600μl进行裂解。11 000 r/min离心15 min。收集上清液，制备10%分离胶和浓缩胶，完全凝固后上样和电泳。电泳、转膜、封闭后，4℃孵育一抗过夜。一抗稀释倍数：NLRP3(1∶1 000)、白细胞介素(IL)-1β(1∶1 000)、IL-6(1∶1 000)、肿瘤坏死因子(TNF)-α(1∶1 500)。室温孵育二抗(1∶20 000)1.2 h,含Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗膜后ECL显影，使用ImageJ软件分析，以GAPDH为内参，计算目的蛋白相对表达量。

1.9统计学处理

采用SPSS23.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验、Games-Howell分析。

2、结果

2.1芍地帕宁方对PD模型小鼠行为学的影响

与对照组比较，模型组爬杆时间明显延长、悬挂评分明显降低(P<0.01),模型组造模成功。与模型组比较，帕宁组爬杆时间明显缩短(P<0.01),悬挂评分明显升高(P<0.05)。见表1。

表1各组行为学、机械、热痛阈、中脑黑质TH表达比较

2.2芍地帕宁方对PD模型小鼠机械、热痛阈的影响

如表1所示，与对照组比较，模型组机械痛阈值、热痛阈明显降低(P<0.01);与模型组比较，帕宁组机械痛阈值、热痛阈明显增加(P<0.05)。

2.3芍地帕宁方对PD模型小鼠脑黑质TH表达的影响

如表1所示，与对照组比较，模型组脑黑质内TH表达明显降低(P<0.01);与模型组比较，帕宁组脑黑质内TH表达明显升高(P<0.01)。对照组脑黑质纹状体区可见大量密集的TH阳性神经元。模型组TH阳性神经元胞体稀少；帕宁组TH阳性神经元相对模型组增多。见图1。

图1各组脑黑质纹状体TH(免疫组化染色法，×200)

2.4芍地帕宁方对各组脑组织NLRP3炎症小体及相关炎症因子蛋白表达比较

如表2、图2所示，与对照组比较，模型组脑组织中NLRP3、IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达显著升高(P<0.01);与模型组比较，帕宁组脑组织中NLRP3、IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达显著降低(P<0.01)。

表2各组脑黑质NLRP-3、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达比较

3、讨论

本研究结果提示，亚急性MPTP/PD疼痛模型小鼠造模成功，服用芍地帕宁方后改善模型小鼠的运动症状的同时，也改善了机械、热伤害感受阈；TH染色结果表明，芍地帕宁方可以提高模型小鼠黑质区域多巴胺能神经元的表达，帕宁组小鼠黑质NLRP3炎症小体及IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子蛋白表达下降，可能是芍地帕宁方改善PD疼痛的机制。

PD的特征是黑质纹状体多巴胺能神经元的大部分丧失，导致复杂的运动和非运动症状[14]。慢性疼痛在PD的整个病程中非常普遍，已被列为PD患者所经历的十大最令人烦恼的症状之一，疼痛可分为伤害性疼痛、神经病理性疼痛及混合型疼痛[15]。在PD中参与疼痛处理的结构基底神经节整合痛觉信息，涉及皮质区、脑干细胞核和脊髓的黑质有助于中央痛觉异常处理[16]。证据表明，大脑中的多巴胺系统参与慢性疼痛的中央调节，下行多巴胺能通路在疼痛调节中起着重要作用[17]。多巴胺能神经元主要起源于黑质(SN)、腹侧被盖区和下丘脑，并投射到大脑的不同区域[18]。可见，黑质纹状体可能参与PD疼痛的调节。

而神经炎症在PD进展的过程中至关重要[19,20]。NLRP3炎症小体可由多种细胞表达，如各种神经元和树突细胞、小胶质细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等，在病变部位的神经炎症中发挥着至关重要的作用，是PD治疗的一个有前景的靶点[21]。NLRP3炎性体是位于细胞质中的多分子复合物，控制细胞因子NLRP3、IL-1β和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-1的加工、成熟和释放，由NLRP3接收器、ASC衔接蛋白、Caspase-1效应蛋白组成[22]。有研究表明，PD患者的中脑黑质纹状体组织中NLRP3的炎症小体大量增加[23],NLRP3炎性小体的过度激活导致多巴胺能神经元的丢失[24]。神经炎症与多巴胺能神经元死亡相关，炎症在PD症状中发挥作用与较高的水平的外周炎性因子如IL-1β、IL-6和TNF-α有关[25]。

NLRP3炎症小体可被多种刺激激活，与IL-1β、TNF-α 等炎性细胞因子的分泌有关[26,27]。此外IL-1β 在保护成年雄性小鼠的黑质多巴胺能神经元发挥重要作用[28]。早期炎症小体抑制可以减少神经炎症并防止进行性PD中α突触核蛋白小鼠模型中的DA细胞死亡[29],表明NLRP3炎症小体的激活在PD发病机制有关键作用。相关研究表明，β-石竹烯通过抑制NLRP3炎症小体，减少神经炎症，并在PD模型中保护多巴胺能神经元[30],可通过中枢和外周抑制NLRP3炎症小体介导的炎症来保护PD小鼠的多巴胺能神经元[31,32]。

中医学虽无PD病名的记载，根据临床表现将PD列为“颤病”范畴，病机以肝肾亏虚、气血不足、虚风内动为本，风火痰瘀夹杂、本虚标实互结为标。肝肾不足、瘀血及内风始终贯穿于本病发生发展及转归的各个阶段，研究建议用扶正祛瘀法治疗PD[33]。中医药治疗PD可能与中药复方中有效成分在不同水平上的抗PD机制包括抗凋亡、抗炎症、抗氧化应激、恢复线粒体功能、调节自噬和神经递质等有关[34]。芍地帕宁方在治疗PD中临床上取得较好疗效，已发现对于患者运动症状、抑郁、认知和睡眠均有改善，可明显改善患者生活质量[13]。熟地黄性微温，味甘，有滋补肝肾、补血滋阴、益精填髓的功效。地黄多糖部分还具有较强的抗炎作用，可降低小鼠血中TNF-α、IL-6,有效地改善小鼠血管炎症和保护神经元作用[35,36]。熟地黄通过抑制p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号减轻6-羟基多巴胺(OHDA)诱导的多巴胺能神经细胞氧化应激，减少细胞凋亡起到保护多巴胺神经元活性的作用[37,38],在治疗PD上具有一定的作用。方中白芍平肝止痛，敛阴止汗，研究认为，芍药具有对PD的多巴胺神经元有保护作用[39];白芍中筛选出13种活性成分和数个靶基因和免疫炎症信号通路、抑制细胞凋亡等在疼痛的研究中存在关联[40];二者相配，共为君药，共奏滋补肝肾，养血调经之效。

方中枸杞子入肝、肾经，具有滋补肝肾的功效，为臣药。研究发现，白芍总苷胶囊[41]能减少炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达，抑制NLRP3炎症小体的激活；枸杞提取物在MPTP诱导的丝虫PD病理模型中改善了运动能力、多巴胺水平和TH活性[42];枸杞子主要活性成分枸杞多糖具有通过抑制NLRP3炎症小体的活化及降低炎症因子IL-1β的释放[43]。肉苁蓉性甘、温，归肾、大肠经，具有补肾阳，益精血的作用，为臣药。现代研究发现，肉苁蓉主要活性成分松果菊苷可降低炎症因子TNF-α水平[44],通过调节IL-6/Janus激酶(JAK)2/信号转导及转录激活蛋白(STAT)3通路发挥保护黑质多巴胺能神经元的作用[45]。地龙咸寒清泄，入肝经，具有清热定痉，通络的作用，为佐药。现代研究发现，地龙提取物能够抑制多种促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的产生，抑制MAPK/NF-κB/NLRP3信号通路的激活[46]。鸡血藤性温，味苦、甘，归肝、肾经。具有补血活血、通络的功效，为佐药。许多研究表明，鸡血藤[47]提取物和纯成分具有的抗炎和抗氧化的作用。诸药合用共奏滋补肝肾，活血，扶正祛瘀之功。从现代研究来看，本中药复方各组成部分在PD中起到保护多巴胺神经元的作用。

本研究中，经MPTP造模[48]的PD小鼠运动能力明显下降，小鼠中脑黑质TH阳性神经元稀少，NLRP3炎症小体及相关炎症因子表达增加，多巴胺能神经元表达显著下降。而应用芍地帕宁方治疗后，PD小鼠运动症状和疼痛得到改善；同时小鼠中脑黑质纹状体区TH阳性神经元相对增多，NLRP3炎症小体及相关炎症因子表达水平明显下降，多巴胺能神经元表达升高。

综上，芍地帕宁方可显著降低小鼠NLRP3炎症小体及IL-1β、TNF-α、IL-6等炎症因子蛋白的表达，提高黑质多巴胺能神经元表达而改善亚急性MPTP/PD模型小鼠疼痛。

参考文献:

9蒋齐军,熊涛.中医药治疗帕金森病研究进展[J].光明中医,2023;38(7):1406-610.

10袁灿兴,刘振国.中西医结合治疗早期帕金森病专家共识(2021) [J].上海中医药杂志,2022;56(1):1-6.

基金资助:2021年安徽省高校优秀拔尖人才培育资助项目(gxgwfx2021028); 2021年安徽省高校科学研究项目(KJ2021A058); 2022年安徽省重点研发计划(2022e07020025); 2022年安徽省卫生健康科研项目(AHWJ2022b015); 2024年安徽省高等学校科学研究项目(2024AH050998); 2021年安徽中医药大学临床科研项目(2021yfylc06);

文章来源:夏阿龙,杨文明,朱四欢,等.基于黑质炎症小体NLRP3信号通路探讨芍地帕宁方调控帕金森病小鼠疼痛的机制[J].中国老年学杂志,2024,44(21):5275-5280.