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新型肠促胰岛素双受体激动剂对亚急性帕金森病小鼠步态行为的影响及机制研究

2021-09-13 153 上传者：管理员

摘要：目的研究新型胰高血糖素样肽1(GLP-1)/葡萄糖依赖性促胰岛素样肽双受体激动剂DA-CH5对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)所致亚急性帕金森病(PD)小鼠步态运动行为的影响，并对比分析其与GLP-1受体激动剂NLY01的效果。方法将48只雄性C57BL小鼠随机分为对照组、MPTP组、MPTP+DA-CH5组(联合1组)、MPTP+NLY01组(联合2组),每组12只。在PD建模第7天进行行为学测试，采用免疫组织化学染色观察小鼠脑组织黑质致密部酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数。结果与对照组比较，MPTP组步态实验步幅、前爪摇摆时间百分比、后爪摇摆时间百分比、转棒实验掉落潜伏期、旷场实验总移动距离、中脑黑质区TH阳性细胞数、TH和Bcl-2表达明显降低，后爪步幅宽度、α突触核蛋白、Bax、Bax/Bcl-2比值明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与MPTP组比较，联合1组和联合2组步态实验步幅、前爪摇摆时间百分比、后爪摇摆时间百分比、转棒实验掉落潜伏期、旷场实验总移动距离、TH阳性细胞数、TH及Bcl-2表达明显升高，联合1组后爪步幅宽度、α突触核蛋白、Bax、Bax/Bcl-2比值明显降低(P<0.01)。联合1组步态实验步幅、前爪摇摆时间百分比、后爪摇摆时间百分比、转棒实验掉落潜伏期、旷场实验总移动距离、TH阳性细胞数、TH、Bcl-2表达明显高于联合2组(P<0.05,P<0.01),后爪步幅宽度、α突触核蛋白、Bax、Bax/Bcl-2比值明显低于联合2组[(37.50±2.20)mmvs(44.99±1.58)mm,0.45±0.03vs0.97±0.02,0.70±0.03vs0.88±0.05,0.89±0.08vs1.36±0.11;P<0.05,P<0.01]。结论DA-CH5可抑制小鼠PD导致的步态行为学障碍，减少酪氨酸神经元丢失，具有神经保护作用，且效果优于NLY01。

关键词：
α突触核蛋白
帕金森病
步态失调
肠促胰岛素类
肠抑胃肽
胰高血糖素样肽1
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帕金森病(PD)是第二大中枢神经系统慢性退行性疾病，给我国造成严重的社会经济负担[1,2,3]。降低PD患病率、延缓疾病进展可减轻未来PD的经济负担，具有重要的价值。研究发现，2型糖尿病患者PD患病风险更高，进展更快，表型更严重。胰岛素信号通路可能通过影响胰岛素失调、神经炎症、线粒体功能障碍而导致神经退行性变[4]。

胰高血糖素样肽1(GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素样肽(GIP)由肠道内分泌细胞分泌。GLP-1受体激动剂已经在临床上用于2型糖尿病的治疗，效果良好[5]。本课题组及其他研究者已经发现，上述激动剂类似物对PD和阿尔茨海默病等有改善作用[6,7]。PD临床表现分为运动和非运动症状[4]。运动障碍对患者的生活质量和自理能力产生不良后果，如何改善运动症状已经成为研究热点。新型GLP-1/GIP双受体激动剂DA-CH5可同时激活2种受体，且更容易穿过血脑屏障。现今有1种GLP-1受体激动剂NLY01对2型糖尿病的治疗效果更佳，但其在PD小鼠模型的神经保护作用有待进一步研究。本研究旨在对比分析DA-CH5和NLY01对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)所致PD小鼠模型步态行为的改善作用。

1、材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂

C57BL雄性健康小鼠[SXK(晋)2015-0001)],8周龄，体质量(22±5)g,购于山西医科大学实验动物中心。

DA5-CH5和NLY01,白色粉末，从中国肽有限公司(中国上海)获得，纯度为95%,MPTP用0.9%生理盐水配制，浓度为25nmol/(kg·d),购于美国sigma公司。兔抗鼠黑质致密部酪氨羟酸化酶(TH)抗体、ɑ突触核蛋白抗体(Abcam'sRabMabTechnology),Bcl-2抗体、Bax抗体及β肌动蛋白(β-actin)多克隆抗体(Bioworld生物科技公司)。

1.2 实验分组和模型制备

将48只雄性C57BL小鼠随机分为对照组、MPTP组、MPTP+DA-CH5组(联合1组)、MPTP+NLY01组(联合2组),每组12只，对照组给予生理盐水0.1ml腹腔注射，MPTP组、联合1组、联合2组腹腔注射MPTP25mg/(kg·d),1次/d,连续7d,诱导PD模型，联合1组、联合2组小鼠在MPTP注射后30min分别给予腹腔注射DA-CH525nmol/(kg·d)、NLY0125nmol/(kg·d),对照组和MPTP组小鼠给予等体积的0.9%生理盐水，1次/d,连续7d。

造模成功标准：第6～7天小鼠注射药物后，出现活动受到限制、连续性肢体颤动、四肢僵硬、竖毛、吞咽活动频繁、运动迟缓、弓背以及尾僵直等症状。

1.3 行为学实验

1.3.1 步态分析实验

小鼠暗环境下适应1晚，实验前让各组小鼠习惯适应30cm长度的玻璃跑道。采用BcamCapture软件采集小鼠爪印，步态分析参数包括步幅、站立时间百分比、摇摆时间百分比、步幅宽度、平均印痕面积等。

1.3.2 转棒实验

在给药前，对所有小鼠进行连续3d的预备训练。测试时把小鼠置于转棒上，转棒从0加速到20r/min,加速时间180s。第7天在注射药物后1h正式测试，间隔30min再测试2次，转棒速度从0加快到30r/min,总时间300s。记录各组小鼠从转棒上第一次跌落时间，取平均值。

1.3.3 旷场实验

采用圆形旷场(直径35cm,高40cm),将每只小鼠置于旷场中央，并在随后10min内对它的运动活动进行录像，通过计算机跟踪系统进行分析。每只小鼠实验后，用75%乙醇擦拭该区域，以防止嗅觉反应造成的误差。旷场实验由1位对分组不知情人员进行测试。

1.4 标本制备与检测

1.4.1 小鼠脑组织分离与固定

造模以及行为学评价结束后，每组取6只小鼠为免疫组织化学染色取材，10%水合氯醛(3ml/kg,腹腔注射)麻醉后，先后用100ml0.9%生理盐水和100ml4%多聚甲醛溶液进行心脏灌注。取出大脑置于4%多聚甲醛溶液中，固定组织过夜。通过梯度酒精脱水浴和二甲苯自动生物组织脱水机梯度脱水，中脑组织石蜡包埋。另外6只小鼠为Westernblot实验取材，将小鼠麻醉，200ml0.9%生理盐水进行心脏灌注，取完整脑组织，冰上分离中脑组织储存在-80℃冰箱中。

1.4.2 苏木精-伊红染色

分别取各组小鼠中脑组织，选择4μm厚度连续冠状切片，烘干脱蜡，苏木精染色7min,流动的自来水冲洗2min,盐酸酒精分化2～5s,水溶伊红染色液对组织进行染色4min后脱水、透明，封固。观察中脑组织是否符合预期及比较各组结构变化。

1.4.3 免疫组织化学染色

采用免疫组织化学染色观察小鼠中脑组织TH阳性细胞数。按照试剂盒说明进行操作。在显微镜放大视野后，随机选取每组小鼠黑质不重叠的脑片进行拍摄(n=6),镜下查看组织微观结构变化，阳性细胞呈棕黄色，用ImageJ软件进行阳性细胞统计分析。

1.4.4 Westernblot检测

采用Westernblot检测脑组织TH、α突触核蛋白、凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达。以β-actin为内参照，通过ImageLab3.0系统进行分析。

1.5 统计学方法

采用SPSS23.0软件，计量资料以x¯±s表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 各组小鼠步态实验比较

与对照组比较，MPTP组步幅、前爪摇摆时间百分比、后爪摇摆时间百分比、前爪平均印痕面积、后爪平均印痕面积明显减少，前爪步幅宽度、后爪步幅宽度、站立时间百分比明显升高(P<0.01)。与MPTP组比较，联合1组和联合2组步幅、前爪摇摆时间百分比、后爪摇摆时间百分比、后爪平均印痕面积及联合1组前爪平均印痕面积明显增加，联合1组和联合2组后爪步幅宽度及联合2组站立时间百分比明显降低，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。联合1组步幅、前爪摇摆时间百分比、后爪摇摆时间百分比、前爪平均印痕面积、后爪平均印痕面积明显高于联合2组，后爪步幅宽度明显低于联合2组(P<0.05,P<0.01,表1)。

2.2 各组转棒和旷场实验比较

与对照组比较，MPTP组转棒实验掉落潜伏期和旷场实验总移动距离明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。与MPTP组比较，联合1组和联合2组转棒实验掉落潜伏期和旷场实验总移动距离明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。联合1组转棒实验掉落潜伏期和旷场实验总移动距离明显高于联合2组，差异有统计学意义(P<0.05,表2,图1～4)。

2.3 各组TH阳性细胞数比较

对照组、MPTP组、联合1组、联合2组小鼠中脑黑质区TH阳性细胞数分别为(14.00±1.41)个、(3.50±1.05)个、(12.50±1.05)个、(7.50±1.05)个。与对照组比较，MPTP组小鼠中脑黑质区TH阳性细胞数明显降低(P<0.01)。与MPTP组比较，联合1组和联合2组小鼠中脑黑质区TH阳性细胞数明显升高(P<0.01)。联合1组小鼠中脑黑质区TH阳性细胞数明显高于联合2组(P<0.01,图5～8)。

2.4 各组TH和α突触核蛋白表达比较

与对照组比较，MPTP组TH表达明显降低，α突触核蛋白表达明显升高(P<0.01)。与MPTP组比较，联合1组和联合2组TH表达明显升高，联合1组α突触核蛋白表达明显降低(P<0.01)。联合1组TH表达明显高于联合2组，α突触核蛋白表达明显低于联合2组(P<0.01,表3)。

2.5 各组小鼠中脑Bax和Bcl-2表达比较

与对照组比较，MPTP组小鼠中脑Bax、Bax/Bcl-2比值明显上升，Bcl-2表达明显降低(P<0.01)。与MPTP组比较，联合1组Bax、Bax/Bcl-2比值明显降低，Bcl-2表达明显升高(P<0.01)。联合1组Bax、Bax/Bcl-2比值明显低于联合2组，Bcl-2表达明显高于联合2组(P<0.01,表4)。

3、讨论

随着老龄化进程的加剧，PD已经给病患及其家属甚至整个社会产生了严重的影响和负担[3]。典型的运动表现主要为肌僵直、双手搓丸样震颤、运动迟缓及步态异常等，严重影响患者生活质量。黑质内多巴胺神经元的缺失，与运动障碍息息相关[8]。α突触核蛋白参与调节多巴胺的合成，受到刺激后，α突触核蛋白发生错误折叠和聚集，产生神经毒性作用，包括影响多巴胺的处理和合成以及促进多种细胞系和动物模型中枢神经系统中细胞的凋亡[9]。Bcl-2、Bax是细胞凋亡Bcl-2家族蛋白家族中最具有代表性的基因，Bcl-2可以抑制Bax从而提高细胞抗氧化能力[10]。

左旋多巴代替治疗虽能暂时延缓PD的发病进程，但长期使用也会存在一定副作用，其中，最严重副作用是运动障碍、损害步态[11]。GLP-1和GIP类似物起始用于糖尿病的治疗，但近年来研究发现，其对神经系统疾病有保护作用[12]。GLP-1类似物在治疗老年糖尿病患者后，不仅可以更好地控制血糖和炎症，还能更好的减少骨骼肌参数、保持体质量、力量和体能[13]。

步态和平衡障碍是老年人跌倒和受伤的主要原因，随年龄递增而表现的步态协调障碍与发病率、致残率和病死率增加、认知能力受损和丧失独立性有关[14]。PD步态逐渐会发展为冻结步态，冻结步态PD患者中脑运动区存在相对应的结构和功能的改变。其症状可能会在需要精确调节步长和步态等活动中变得明显，例如转弯或开始行走。

步态分析已然成为评估PD发展程度的重要方法，弥补了行为学测试一些方法存在的种种缺陷，满足了日益增加的基础和临床研究需求。其中，步长、步幅、步频和步速等指标已应用于临床PD患者的运动功能评估[15]。跑步机步态等分析系统对检测PD动物模型的运动缺陷存在不足之处，本实验步态分析系统可自动检测小鼠众多步态参数，以及对其自动进行分析，弥补了经典行为学测试的短板与不足，具有明显优势。步态参数中的平均印痕面积是足部在整个站立期所印痕的面积，反映小鼠行走时肢体力量；步幅宽度是双脚的横向长度，是反映走路稳定性的指标，检测到的长度越窄，姿势的稳定性越差；站立时间百分比与摇摆时间百分比可以反映步态的协调性。而转棒实验和旷场实验反映了小鼠的平衡能力和运动探索能力。

本研究采用了对MPTP敏感的C57野生小鼠，制备的模型具有明显的运动行为学变化，在转棒上停留时间减少、在旷场中探索性运动能力下降以及步态实验中各个项目指标功能减退。根据以上分析步态指标结果，与联合2组比较，联合1组小鼠使用DA-CH5后，显著改善了小鼠步幅、后爪步幅宽度、前爪摇摆时间百分比，而对后爪平均印痕面积、后爪摇摆时间百分比改善作用更佳。说明DA-CH5对MPTP小鼠肌力、稳定性和协调性比NLY01具有更好的效果。本研究还发现，与MPTP组比较，联合2组使用NLY01后，小鼠前爪平均印痕面积无明显增加，站立时间百分比却明显减少，联合1组和联合2组前爪步幅宽度都没有明显改善，说明可能二者对于某些指标具有不同的改善作用，且本研究采用的亚急性小鼠模型，或许对于慢性PD小鼠可能作用也有所差异。

转棒实验和旷场实验结果显示，联合1组DA-CH5对于平衡能力和运动探索能力的效果较联合2组NLY01更好。本研究TH、α突触核蛋白表达和Westernblot检查结果与行为学结果相一致，在病理方面证明了造模成功以及DA-CH5比NLY01展现出的更好的疗效，机制可能是通过减少α突触核蛋白聚集以进一步改善对多巴胺合成的阻碍作用以及减少细胞凋亡起到神经保护作用。本实验证明，DA-CH5显著降低PD小鼠Bax/Bcl-2比值，抑制细胞凋亡，其与行为学变化和TH、α突触核蛋白表达趋势一致。

综上所述，肠促胰岛素类似物在PD小鼠运动障碍中发挥了有效作用，且新型GLP-1/GLP双受体激动剂DA-CH5较GIP单受体激动剂NLY01展现出了更好的效果，这对于以后PD的治疗提供了实验数据和临床治疗方向。

文章来源：吕妙君,冯鹏,郭雅静,程慧峰,薛国芳.新型肠促胰岛素双受体激动剂对亚急性帕金森病小鼠步态行为的影响及机制研究[J].中华老年心脑血管病杂志,2021,23(09):908-912.