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舒肌汤对左旋多巴诱发帕金森异动症大鼠神经保护作用的实验研究

2024-05-14 65 上传者：管理员

摘要：目的:探讨舒肌汤对左旋多巴(L-dopa)诱导帕金森(PD)异动症大鼠的神经保护作用及机制。方法:SD大鼠单侧注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)建立制备PD模型，随后腹腔注射L-dopa、苄丝肼诱导异动症，随机分为模型组、低剂量舒肌汤组(10 g/kg)、中剂量舒肌汤组(20 g/kg)、高剂量舒肌汤组(40 g/kg),同时设立假手术组，每组6只，连续灌胃给药28 d,于治疗的第1、7、14、21、28天进行不自主运动(AIM)评分。治疗结束时，测定大鼠负重单肢跨步数；ELISA测定脑组织MDA、GSH、SOD、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10水平，双荧光免疫染色测定CD11b+ Iba1+小胶质细胞数量，Western blot测定络氨酸羟化酶(TH)蛋白表达。结果:与假手术组比较，模型组大鼠AIMs评分升高，单前肢跨步数减少，脑组织MDA、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10水平升高，GSH、SOD水平降低，CD11b+ Iba1+小胶质细胞数量增加，TH蛋白表达减少(均P<0.01)。与模型组比较，治疗第7天后各组大鼠AIMs评分降低；治疗结束时各组大鼠单前肢跨步数增加，脑组织MDA、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10水平降低，CD11b+ Iba1+小胶质细胞数量增加，TH蛋白表达增加(P<0.05);中、高剂量舒肌汤组大鼠GSH、SOD水平增加(P<0.05)。结论:舒肌汤对L-dopa诱导PD异动症大鼠的症状具有改善作用，其机制可能与抑制小胶质细胞激活下调各类炎性介质释放、减少氧化应激损伤、促进TH蛋白表达有关。

关键词：
TH蛋白
小胶质细胞
左旋多巴
帕金森异动症
氧化应激
炎性因子
舒肌汤
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帕金森病(PD)是一种常见的精神系统退行性疾病，而异动症是一种较为严重的PD运动并发症，主要临床特征为舞蹈样、投掷样和肌张力障碍等刻板重复的不自主运动(AIM),多累及四肢和躯干[1,2]。异动症的发生机制虽然尚未完全明确，但目前认为异动症的发生与左旋多巴(L-odopa)用量过多有关[3,4]。小胶质细胞参与神经炎症，与PD发生有关[5]。目前研究发现，L-dopa诱导的PD异动症大鼠损毁侧脑组织内小胶质细胞增生明显[6,7],提示小胶质细胞的异常激活可能与L-dopa诱导的PD异动症发生有关。前期实验成果证明中药舒肌汤能够有效保护和修复PD模型大鼠DA神经元，促进DA分泌，并能够减少神经肌肉接头处乙酰胆碱的释放，起到缓解PD大鼠肌僵直作用[8,9]。舒肌汤对PD异动症的作用未知。本研究通过建立PD动物模型，探讨舒肌汤对PD异动症的作用。

1、材料与方法

1.1 实验动物

30只健康成年雄性SD大鼠，体质量(200 ±20)g, 购于斯贝福(北京)生物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2019-0010)。饲养于浙江鹰旸医药研发有限公司，实验动物使用许可证：SYXK(浙)2021-0033,恒温(22±2)℃,中等湿度(50%～60%),每12 h明暗交替，换风次数15～20次/h。

1.2 实验药物和试剂

舒肌汤制备：毛叶轮环藤、青风藤、粉防己、厚朴和山梗菜按照1∶1∶2∶2∶1混合后，于水浸泡30 min。水煎两次，每次1 h, 合并两次水煎液。低温浓缩至生药浓度为2 g/mL,保存备用。左旋多巴：Sigma, 批号：1256W431H1);苄丝肼、6-羟基多巴胺：上海源叶生物，批号：D1256FA236、A21GS158368;盐酸阿扑吗啡购自中国食品药品检定研究院，批号：100839-201803。白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒：江苏酶免实业有限公司，批号：20220520、20220502、20220509、20220506;总超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司，批号：101121220128、022622220302;谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号：20220510;离子钙接头蛋白抗原(Iba1)抗体、CD11b抗体：Abacm公司，批号：GR3054212-2、GR2955412-1;DAPI抗体：购自北京索莱宝，批号：G1012;络氨酸羟化酶(TH)、肌动蛋白(β-actin)抗体：Affinity抗体公司，批号：44y6385、35s4163;蛋白定量试剂盒：北京索莱宝，批号：20220218。

1.3 实验仪器

Micro17R低温高速离心机：德国赛默飞；AE2000显微镜：Motic; CMaxPlus酶标仪：美国MD;NIKON ECLIPSE C1荧光显微镜：日本尼康；脑立体定位仪：众实迪创；化学发光仪：勤翔有限公司。

1.4 PD异动症模型大鼠建立

大鼠麻醉固定头部，参照脑立体定位图谱，确定右侧前脑束坐标。钻孔，随机选取24只大鼠注射3 μL 6-OHDA,留针10 min, 出针后缝合创面。3 周后，腹腔注射阿扑吗啡(0.5 mg/kg),测定大鼠旋转次数(不低于7 次/min)进行PD模型复制评估[10]。另取6 只设为假手术组，用生理盐水替代进行注射。左旋多巴、苄丝肼溶于含0.2 % VC的生理盐水中。24只造模大鼠腹腔注射50 mg/kg左旋多巴甲酯、25 mg/kg苄丝肼，2次/天，连续28 d, 以建立PD异动症大鼠[11];假手术组大鼠用0.2 % VC的生理盐水替代注射。

1.5 分组给药

24只造模大鼠随机分为模型组、低剂量舒肌汤组、中剂量舒肌汤组、高剂量舒肌汤组。舒肌汤各剂量组分别灌胃10、20、40 g/kg舒肌汤生药[9],模型组组、假手术组灌胃等体积生理盐水，1次/日，连续28 d。

1.6 观察指标及测定

1.6.1 异常不自主运动(AIM)评分

于给药第1、7、14、21、28天观察大鼠以下AIM症状并评分[12]:(1)口周：口舌不自主地向毁损对侧舔食；(2)前肢：毁损对侧前肢不自主地拍打；(3)轴性运动：躯体和头颈不自主向毁损对侧扭转；(4)运动：身体不自主转圈。根据其有无和严重程度对以上4类AIM进行评分(0～4 分):0 分为正常；1～4 分：分值越高表示肌僵直程度越高。

1.6.2 负重单前肢功能测定

单手固定大鼠后半部躯体和双后肢，另一只手托起一条前肢，即将大鼠重心全部落于剩余前肢上。沿着大鼠负重肢体的方向以18 cm/s 的速度匀速移动，记录移动时大鼠负重前肢的跨步数。重复 3 次，每次间隔 30 min, 取平均值作为大鼠前肢跨步数。

1.6.3 脑组织氧化应激反应指标和炎性因子测定

安乐死大鼠，摘取大鼠黑质组织保存。取适量组织剪碎，加入适量PBS,在预冷的匀浆器中充分研磨，令脑组织匀浆化。随后离心机设置10 000 r/min离心10 min, 取上清液。ELISA检测上清液MDA、GSH、SOD、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10水平，按照试剂盒说明书测定。

1.6.4 CD11b+ Iba1+小胶质细胞测定

采用双免疫荧光染色。常规制备脑组织石蜡切片，脱蜡至水。修复切片，洗涤。选取切片观察部位，画圈确定染色区域，血清封闭。轻甩掉封闭液，加入Iba1(1∶10 000)、CD11b(1∶4 000)抗体，4 ℃孵育过夜。清洗切片，加二抗覆盖组织，室温避光孵育50 min。清洗后，DAPI复染切片10 min。清洗，封片。400高倍镜下观察视野下。

1.6.5 脑组织TH蛋白表达测定

取大鼠脑黑质组织，剪碎后制备匀浆。离心提取上清液，定量总蛋白浓度后，电泳转膜。封闭后加入稀释的TH抗体，摇床孵育反应。隔天取出，清洗，封闭后孵育对应二抗。化学发光仪显影蛋白条，软件分析灰度值，以β-actin做内参，确定TH蛋白相对含量。

1.7 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析。多组间计量资料符合正态分布且符合方差齐性检验，用单因素方差分析；组间两两比较采用Tukey检验。所有数据以均值±标准差表示。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 舒肌汤对大鼠AIM评分的影响

见表1。

2.2 舒肌汤对大鼠前肢功能的影响

见表2。

2.3 舒肌汤对大鼠脑黑质氧化应激反应的影响

见表3。

2.4 舒肌汤对大鼠脑黑质炎性因子的影响

表4。

表1 各组大鼠给药期间AIMs评分比较

表2 各组大鼠前肢负重跨步数比较

表3 各组大鼠脑黑质MDA含量和GSH、SOD活性比较

表4 各组别大鼠脑黑质IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10含量比较

2.5 舒肌汤对大鼠脑组织小胶质细胞激活的影响

见表5。模型组大鼠平均视野内CD11b、Iba1表达的小胶质细胞增加；而各舒肌汤剂量组大鼠平均视野内CD11b、Iba1表达的小胶质细胞减少。

表5 各组大鼠脑组织小胶质细胞激活数量比较

2.6 舒肌汤对大鼠脑黑质TH蛋白表达的影响

见表6,图1。与假手术组相比，模型组大鼠脑黑质TH蛋白表达显著降低(P<0.01);与模型组比较，各舒肌汤组大鼠黑质TH蛋白表达均显著升高(P<0.01)。

图1 各组大鼠脑组织TH蛋白表达的Western blot检测结果

表6 各组大鼠脑组织TH蛋白相对表达量比较

3、讨论

近年来我国PD发病率、患病率、死亡率均出现大幅度增加，PD疾病负担逐年加重[13]。L-dopa替代治疗是目前临床治疗PD最为有效的治疗方法，贯穿治疗全程；但随着治疗进展，PD运动并发症不可避免的出现，标志着PD病程中晚期的到来[14,15]。中医根据异动症的临床表现及发生机制将其归属于“颤证”,属本虚标实证，本为肝肾亏虚、气血不足，而标为痰、瘀、风、毒等致病因素[16]。中医治疗PD异动症采取标本兼治的原则，在治疗PD的基础之上，加强平肝息风、解毒袪邪。舒肌汤组成包含毛叶轮环藤、青风藤、粉防己、厚朴和山梗菜，其中青风藤治“风”、防己能“利湿，除风”、厚朴能“祛风寒”,而毛叶轮环藤则能松弛肌肉，前期研究结果表明，舒肌汤对PD大鼠破损DA能神经元具有保护效果，并能减轻肌僵直症状[8,9]。

6-OHDA诱导黑纹状体损伤建立PD动物模型，随后用L-dopa诱导是制备PD异动症动物模型的的方法之一[17]。本研究中模型大鼠在造模后，口周、前肢、轴性、运动各项AIM评分增加，与既往研究报道相符[18],可表明本次研究所用模型能较可靠反映PD异动症表现。模型大鼠在负重情况下单肢前行能力下降，表明运动能力下降。而给予舒肌汤治疗后，大鼠的AIMs评分降低，负重单肢前行能力提高，提示舒肌汤治疗可改善模型大鼠的AIM症状，提高运动能力。李佳园等[19]研究表明，L-dopa治疗虽可明显改善PD异动症大鼠的运动损伤，但同时也促进了大鼠脑纹状体氧化应激反应。本研究发现，模型组大鼠脑组织MDA含量升高，GSH、SOD活性下降，给予舒肌汤治疗后，大鼠脑组织MDA含量降低，GSH、SOD活性升高，表明舒肌汤对模型大鼠的氧化应激改善作用。

小胶质细胞激活并分泌细胞因子可介导神经炎症产生，是驱动L-dopa诱导PD异动症发生发展的重要原因之一[20]。小胶质细胞是脑内主要免疫性细胞，可产生促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6等，具有促炎和抗炎的双向免疫作用[21]。CD11b、Iba1为小胶质细胞特征性表明标记之一，CD11b+Iba1+小胶质细胞表达的增多可提示小胶质细胞免疫功能的改变，与神经炎症的发生相关[22,23]。本研究发现，在模型组大鼠黑质内CD11b+Iba1+小胶质细胞数量增加，IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10水平升高，表明小胶质细胞活化并产生了大量炎症因子；给予舒肌汤治疗后，大鼠纹状体内CD11b+Iba1+小胶质细胞数量减少，IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10水平下调，提示舒肌汤可通过抑制小胶质细胞的激活下调炎性细胞因子水平，减轻模型大鼠的神经炎症损伤。TH是DA的合成限速酶，TH在PD小鼠脑组织的低表达表明DA能神经元的丢失[24,25]。而L-dopa的治疗并不对PD大鼠TH的恢复表达具有任何影响[19]。本研究发现，模型组大鼠纹状体TH蛋白表达显著降低，而经舒肌汤治疗后，大鼠纹状体TH蛋白表达显著升高；表明舒肌汤可恢复模型大鼠黑质TH蛋白表达，具有神经保护作用。

综上所述，本研究发现舒肌汤能改善PD+L-dopa大鼠AIM症状，提高大鼠运动能力，其神经保护作用可能通过抑制氧化应激、抑制小胶质细胞激活下调炎症因子水平，促进TH蛋白表达共同实现。

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