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白藜芦醇对秀丽隐杆线虫帕金森病模型的神经保护作用

2024-06-26 500 上传者：管理员

摘要：目的探讨白藜芦醇对秀丽隐杆线虫帕金森病模型神经保护作用及其可能的机制。方法将BZ555线虫分为对照组、6-羟基多巴胺组及白藜芦醇组，检测线虫多巴胺神经元的损伤修复情况及帕金森病表型的改变；NL5901线虫分为对照组及白藜芦醇组，检测线虫α-突触核蛋白的聚集情况及帕金森病表型的改变。结果白藜芦醇修复了6-羟基多巴胺诱导的BZ555线虫多巴胺神经元的损伤，降低了NL5901线虫α-突触核蛋白的聚集和活性氧含量，改善了NL5901及BZ555线虫的帕金森病表型。结论白藜芦醇对秀丽隐杆线虫帕金森病模型具有神经保护作用，其作用可能与减轻线虫的氧化应激相关。

关键词：
帕金森病
白藜芦醇
神经保护
神经系统退行性疾病
秀丽隐杆线虫
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帕金森病(PD)是世界范围内常见的神经系统退行性疾病，该病多发生于中老年人，随着人口老龄化加剧，其患病率将显著增加，严重威胁人类健康[1]。至今国内外对PD的研究已有200多年历史，但其病因仍不明，也无根治方法[2]。目前PD的治疗主要包括药物治疗和手术治疗两个方面，其中以药物治疗为主，但均不能根治。药物主要选用多巴胺进行替代治疗，长期服用会出现疗效减退、症状波动、运动障碍等副作用，导致该病治疗效果差，因此可选用一些植物类药物，利用其多靶点作用进行辅助治疗以提高疗效[3,4]。本研究旨在通过对白藜芦醇(RSV)作用于秀丽隐杆线虫PD模型，观察线虫多巴胺神经元、 α-突触核蛋白(syn)及PD表型的变化，探讨RSV对线虫多巴胺神经系统的保护作用，以期发现其治疗PD的潜能及其可能分子机制。

1、材料与方法

1.1材料

线虫菌株：PD转基因线虫模型BZ555:egIs1[dat-1p: :GFP];NL5901:pkIs2386[unc-54p: :a-synuclein: :YFP + unc-119];雌雄同体野生型秀丽隐杆线虫C.elegans Bristol(N2)。线虫由贵州医科大学惠赠。线虫以大肠杆菌OP50为食物，于20℃恒温培养。试剂：RSV(纯度：99.94%,Med Chem Express公司)、6-羟基多巴胺(6-OHDA纯度 ≥97%,Sigma-Aldrich公司);二氢乙锭(DHE,上海麦克林生化科技股份有限公司);胆固醇、琼脂粉(北京索莱宝科技有限公司);酵母粉、蛋白胨(北京奥博星生物技术有限责任公司);其他试剂均为市售分析纯。NGM培养基：400 ml NGM培养基中含1.2 g氯化钠，1.0 g蛋白胨，7.0 g琼脂，高压灭菌后待温度降至60～65℃,依次加入400μl抽滤除菌的以下物质：K2HPO4/KH2PO4缓冲液(21.66 g KH2PO4+9.3 g K2HPO4·3H2O+50 ml去离子水)、MgSO4溶液(6.15 g MgSO4·7H2O+50 ml去离子水)、CaCl2溶液(10.35 g CaCl2·6H2O+50 ml去离子水)、胆固醇溶液(50 mg胆固醇+10 ml无水乙醇)。RSV培养皿的准备：RSV采用二甲基亚砜(DMSO)溶解，用0.22μm的微孔滤过膜除菌，制备成一定浓度原液，用去离子水稀释成不同的浓度，使RSV溶液的最终浓度为25、50μmol/L。向涂布有OP50的NGM培养皿中分别加入200μl不同浓度RSV溶液，作为RSV组，对照(Control)组加入200μl DMSO溶液，培养皿晾干置于4℃冰箱中备用。

1.2多巴胺神经元分析[5]

C.elegans药理模型BZ555的多巴胺神经元特异性表达绿色荧光(GFP)。BZ555线虫暴露于一种神经毒素(如6-OHDA)后会在线虫头部区域观察到多巴胺神经元的形态异常。为了确定RSV是否对线虫多巴胺神经元具有保护作用，本文用6-OHDA诱导线虫多巴胺神经元损伤。将同期化后L1期BZ555线虫接种到各组NGM培养皿中，待线虫培养至L3期后在20℃下用50 mmol/L 6-OHDA处理1 h。随后用M9缓冲液洗涤线虫3次，然后再放入与之前相同的NGM培养皿中继续培养72 h。用M9缓冲液洗涤线虫3次，挑取相应的线虫于2%琼脂垫上，25 mmol/L盐酸左旋咪唑麻醉线虫，用荧光显微镜观察线虫多巴胺神经元形态，用ImageJ软件对线虫头部多巴胺神经元进行荧光定量分析。

1.3α-syn的聚集分析[6]

NL5901是人源 α-syn转基因线虫，当线虫体内有α-syn聚集时可以在线虫体内中观察到GFP。为了确定RSV是否有抑制α-syn聚集的作用，本文用RSV处理NL5901线虫。将同期化后L1期NL5901期线虫接种到各组NGM培养皿中，待线虫培养至L3期，继续培养72 h,用M9缓冲液洗涤线虫3次，挑取相应线虫于2%琼脂垫上，25 mmol/L盐酸左旋咪唑麻醉线虫，用荧光显微镜观察线虫α-syn的聚集，用ImageJ软件对线虫头部α-syn聚集进行荧光定量分析。

1.4食物感知行为分析[7]

当食物(大肠杆菌OP50)存在时，线虫会减少其运动(身体的弯曲)来觅食，这种基础减慢行为与多巴胺神经传递功能有关，经过6-OHDA诱导后，线虫的多巴胺神经会受到损伤，线虫会出现食物感知能力下降，因此本文检测BZ555线虫的食物感知行为，以评估RSV对其多巴胺神经元的功能的影响。同1.2的方法，将6-OHDA处理1 h后的线虫转移到含或不含大肠杆菌OP50的NGM培养皿上。待其适应5 min后，记录20 s内C.elegans的基础减速变化[基础减速=(有细菌时线虫的运动速率/没有细菌时线虫的运动速率)×100%]。

1.5运动能力分析[6]

α-syn聚集会导致线虫行为紊乱，本文研究RSV对NL5901线虫运动能力的影响。将同期化后L1期的N2、NL5901线虫接种到各组培养皿中，待线虫长到L3时期，继续培养72 h,用M9缓冲液洗涤线虫3次，挑取相应的线虫于无OP50的NGM培养皿上，待其适应5 min后，在体视显微镜下观察并记录30 s内线虫身体弯曲的次数，作为线虫运动能力的指标。

1.6寿命分析[6]

与正常N2野生型线虫相比，PD模型线虫寿命更短，因此本文研究RSV对NL5901线虫寿命的影响。将同期化后L1期的N2、NL5901线虫接种到各组培养皿中，此时记为第0天。20℃培养，每日将线虫转移到新的培养皿上，并观察线虫存活情况，当线虫无运动、经铂丝刺激10 s后无反应视为死亡，挑出培养皿，并记录死亡数目。若出现线虫爬出培养基失踪、爬出培养基致死及虫卵在体内孵化压迫内脏致死的情况不记录在内。

1.7氧化指标检测[8]

α-syn的聚集可导致多巴胺神经元被氧化形成H2O2等活性氧(ROS),过量的ROS导致氧化应激产生，氧化应激是PD发病的主要原因[5],因此本文研究RSV对NL5901线虫ROS的影响。将同期化后L1期NL5901线虫接种到各组NMG培养皿中，待线虫长到L3期，继续培养72 h,用M9缓冲液洗涤线虫3次，去上清，每组加入1 ml终浓度为100μmol/L的DHE溶液，20℃避光孵育1 h,孵育结束用M9缓冲液反复清洗3次，挑取线虫用25 mmol/L盐酸左旋咪唑麻醉后于2%的琼脂垫上制片，用荧光显微镜观察线虫ROS含量，用ImageJ软件对线虫ROS进行荧光定量分析。

1.8统计学方法

采用SPSS27.0软件进行单因素方差分析、秩和检验(log-rank)。

2、结果

2.1 RSV改善6-OHDA诱导的BZ555线虫多巴胺神经元损伤

与Control组(21.98±1.43)相比，6-OHDA组多巴胺神经元的GFP强度(13.47±0.82)明显降低(P<0.001),并表现出神经元完整性的丧失，出现树突断裂、断点、缺失。与6-OHDA组对比，经25、50μmol/L RSV组线虫多巴胺神经元的荧光强度明显增加(分别为17.43±1.34、19.43±1.27,均P<0.001),神经元形态的损伤得到修复，其中50μmol/L RSV较25μmol/L RSV效果更明显(P<0.001)。见图1。

图1各组BZ555线虫头部多巴胺神经元荧光显像(×400)

2.2 RSV可减少NL5901线虫α-syn聚集

与Control组(21.78±3.53)相比，25μmol/L(17.14±4.21)和50μmol/LRSV处理的线虫GFP强度(13.86±2.05)明显下降(P<0.001)。见图2。

图2各组NL5901线虫头部 α-syn荧光显像(×200)

2.3 RSV改善BZ555线虫的食物感知行为

与Control组(52.35±8.27)相比，6-OHDA组BZ555线虫的基础减速变化明显升高，食物感知能力(89.10±4.19)明显下降(P<0.001)。与6-OHDA组比较，经25、50μmol/L RSV处理后基础减速变化明显降低，明显提高了线虫对食物的感知能力(58.80±9.36、56.25±7.54,均P<0.001)。

2.4 RSV改善了NL5901线虫的运动缺陷

与N2线虫[(67.75±3.02)次]比较，NL5901线虫身体弯曲率[(42.25±3.09)次]出现明显下降(P<0.001)。NL5901线虫经25μmol/L[(53.80±3.33)次]和50μmol/L[(57.60±4.41)次]RSV处理后，身体的弯曲率出现明显增加(均P<0.001)。同时在观察过程中发现NL5901线虫出现了正弦运动振幅减小，杂乱运动、身体卷曲等情况。经RSV处理后上述运动缺陷得到改善。

2.5 RSV提高了NL5901线虫的寿命

Control组和N2线虫比较，寿命缩短，说明α-syn的聚集引起了线虫的寿命缩短；与Control组相比，25μmol/L和50μmol/L RSV均可延长NL5901线虫的寿命。见图3。

2.6 RSV减少了NL5901线虫ROS含量

与Control组(49.36±4.88)比较，经25μmol/L(35.45±7.34)和50μmol/L(24.75±4.06)RSV处理后，线虫体内ROS荧光强度明显减低(均P<0.001)。见图4。

图3各组NL5901线虫寿命比较

图4各组NL5901线虫体内ROS荧光显像(×100)

3、讨论

目前PD的治疗是一个世界性难题，所以研究者们一直在进行新药研发、手术方式探讨及尝试干细胞治疗。近年来，植物类药物治疗PD也引起了大家广泛关注，且也取得了一些进展。植物类药物可长期服用，副作用较小，可显著提高患者的生活质量，从植物中获取有效的活性成分有望成为防治PD的重要途径[9,10]。

RSV是从红葡萄、虎杖、大豆、花生等植物中提取的一种天然多酚类化合物，可通过抑制神经炎症反应、抑制细胞凋亡、抑制氧化应激等作用来保护多巴胺神经元，从而实现对PD潜在的治疗作用。但因目前的研究有限，也限制了RSV的临床应用[11,12],因此需要更多的研究来确定RSV的疗效。雌雄同体的C.elegans有302个神经元，其中有8个是多巴胺神经元，且每个神经元的定位、走向都很清晰，很容易观察和量化神经细胞的死亡，同时由于其身体具有透明性，可在活体下观察细胞结构和荧光标记蛋白的表达，能够观察到某特定神经元的缺失或存在，这对神经退行性疾病的研究非常重要。更重要的是参与多巴胺合成和转运的途径在线虫和哺乳动物之间是高度保守的，且C.elegans有许多与PD相关的同源性基因，包括LRRK2/lrk-1、PINK1/pink-1、PRKN/pdr-1、DJ-1/djr-1.1/djr-1.2和ATP13A2/ catp-6,基于这些优势，C.elegans已被广泛用于PD的研究[5,13]。因此，本实验选用C.elegans的PD模型来进行研究。

PD主要的病理特征为黑质纹状体多巴胺神经元的大量丧失及路易氏体(主要成分为 α-syn)的形成。典型的临床特征包括运动迟缓、静止性震颤、肌强直及姿势和步态的异常[1,3]。本实验选用BZ555线虫模型观察多巴胺神经元的形态，NL5901线虫模拟 α-syn的聚集，通过上述两个线虫突变株来模拟PD的病理改变及PD的部分表型，并对RSV的作用机制进行探讨。虽然目前PD的发病机制不清，但越来越多的证据表明由ROS诱导的氧化应激是PD的主要病因，从早期PD患者中收集的数据表明，氧化应激增强是疾病初始阶段的一个重要特征，发生在显著的神经元损伤之前，过度的氧化应激可导致多巴胺神经元细胞功能障碍和死亡，导致PD的发生[14,15]。6-OHDA可诱导机体产生过氧化氢、超氧化物离子和羟基自由基等，从而增强氧化应激，导致多巴胺神经元死亡[16]。因此本文选用6-OHDA处理BZ555线虫来诱导多巴胺神经元的损伤。结果表明，经6-OHDA诱导后BZ555线虫出现了多巴胺神经元的损伤、多巴胺相关食物感知行为受损。本研究结果表明，RSV对6-OHDA诱导的多巴胺神经元的氧化应激损伤具有保护作用。 α-syn是构成路易体最主要的蛋白，在家族性和特发性PD的发病机制中都扮演非常重要的角色，有研究显示ROS促进了 α-syn的聚集，α-syn聚集也导致ROS生成，由此产生了恶性循环[17,18],过量的ROS生成导致氧化应激的发生，氧化应激诱导了多巴胺神经元的变性损伤，从而导致PD的发生[19]。本文结果表明，25和50μmol/L RSV处理后NL5901线虫体内的α-syn的聚集减少，ROS的荧光强度分别降低了28%和50%,同时身体的运动缺陷也得到改善，且延长了NL5901线虫的寿命。

综上，RSV可能通过减少ROS的生成，减轻线虫的氧化应激损伤来对线虫PD模型中多巴胺神经系统发挥保护作用。基于PD复杂的发病机制及没有足够有效的治疗方法，因此需更多的研究来进行探讨，研发植物类药物作为辅助用药可能为PD的治疗提供一个新的视角。

基金资助:遵义市科学技术局项目(遵市科合HZ字(2021)101号);

文章来源:张宗敏,梁婧,凌丽,等.白藜芦醇对秀丽隐杆线虫帕金森病模型的神经保护作用[J].中国老年学杂志,2024,44(12):3021-3025.