大脑严重缺氧会导致脑细胞损伤及脑部发育慢等，还会累及神经系统，最终导致偏瘫等疾病产生。但目前缺氧导致的脑损伤具体发病机制仍未完全掌握。缺氧缺血性脑损伤发生后神经元会发生自噬。细胞自噬可通过清除受损细胞或蛋白等参与神经系统疾病的产生及发展过程。微管关联蛋白轻链(LC)3是自噬标志性蛋白，其中LC3Ⅱ最为常见，目前常以LC3Ⅱ来衡量自噬的发生[1]。自噬的过度激活还可能介导细胞程序性死亡，严重威胁患者的生命安全。细胞程序性死亡是一种由受体相互作用蛋白激酶(RIPK)3和混合系列蛋白激酶样结构域(MLKL)调控的程序化细胞死亡方式[2]。但目前其对缺氧缺血性脑损伤的具体作用机制仍未完全了解。在缺氧导致的神经元损伤中，还存在多信号通路的相互作用，其中腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)通路较为常见。王雪如等[3]研究中提出，在神经元缺氧复氧后，通过上调AMPK调控该通路相关蛋白表达，发挥保护神经元的作用。MicroRNA(miRNA)可调控细胞生物学行为，且在缺氧诱导的神经元损伤中发挥重要作用。miR-190是miRNA的成员之一，目前已有研究证实了miR-190在直肠癌[4]、乳腺癌[5]等多种肿瘤中均可调控肿瘤细胞的生物学行为。有报道提示[6],miR-190在神经元中具有一定的作用，特别是在雄性果蝇中，可调节其寿命、神经元活动。另外，Sun等[7]研究中提出，上调miR-190可显著抑制炎性因子表达及小胶质细胞的激活，从而缓解帕金森病小鼠神经元损伤。但目前关于miR-190对神经元活动的具体作用机制尚未完全掌握，且其对AMPK通路的影响也暂未可知。基于此，本实验研究miR-190对缺氧神经元自噬、程序性死亡及AMPK信号转导的作用机制。

1、材料和方法

1.1细胞培养

人大脑原代皮层神经元HCN购自上海美轩生物科技有限公司，将其置于含有10%胎牛血清、1%MEM非必需氨酸溶液(NEAA)、2.5 mmol/L谷氨酸、哌嗪-N′-丙磺酸(EPES)、0.5 mmol/L丙酮酸钠和1%碳酸氢钠的RPMI1640培养基中培养，培养环境为37℃,5%CO2,4 h后更换培养基，每3 d换一次液，培养7 d成熟后进行实验。

1.2实验试剂

自噬抑制剂3-MA(上海雅吉生物科技有限公司，货号：YS-20246R),AMPK抑制剂P5499(上海抚生实业有限公司，批号：1219168-18-9),酶标仪(山东博宇医疗器械有限公司，型号：BK-EL10A),聚合酶链反应(PCR)仪(北京澎昆博远科贸发展有，型号：Life Touch),引物序列(上海泽叶生物科技有限公司，货号：ZY71071-3),CCK8溶液(上海富衡生物科技有限公司，货号：C200-10),流式细胞仪(上海实维实验仪器技术有限公司，型号：Aria),LC3Ⅱ、AMPK、p-AMPK、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p-mTOR一抗(武汉艾美捷科技有限公司，货号分别为：PSI-79-626、GBS-ITT0222-50u-F、GBS-ITT0222-100u-H、GBS-IT16229、GBS-ITT6120-50u-B),辣根过氧化物酶二抗(广东固康生物科技有限公司，货号：GtxOt-096-D)

1.3模型建立

根据文献[8]将常规培养的神经元取出，放入条件为37℃、99.99 ml/L氮气(N2)的缺氧箱中培养。

1.4转染及分组

取部分厌氧处理后HCN细胞进行常规培养作为对照组。另将部分厌氧处理后HCN细胞接种于6孔板中培养，待细胞回合度达到45%～55%时，按说明书操作，以用LipofectamineTM3000试剂为介导将miR-190 mimic(模拟物)、miR-NC转染至细胞，分别作为miR-190 mimic组及miR-190-NC组。用LipofectamineTM3000试剂为介导将miR-190 siRNA(抑制物)、miR-NC转染至细胞，培养6～8 h后更换培养液，48 h后收集细胞，备用。另取部分厌氧处理后HCN细胞给予含10 mmol/L自噬抑制剂3-MA及5μmol/L AMPK抑制剂P5499的DMEM-F12完全培养基预处理细胞1 h后，再用正常DMEM-F12完全培养基孵育细胞12 h。分为自噬抑制剂组、AMPK抑制剂组、miR-190 mimic+自噬抑制剂组、miR-190 mimic+AMPK抑制剂组、miR-190 siRNA+自噬抑制剂组、miR-190 siRNA+AMPK抑制剂组，用于Western印迹实验。

1.5 qRT-PCR检测细胞中miR-190及程序性死亡相关指标RIPK3、MLKL表达

采用Trizol法提取厌氧处理后HCN细胞中的总RNA,逆转录得到cDNA后行qRT-PCR,反应条件：95℃预变性2 min, 95℃变性30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸30 s,共循环40次，以GAPDH为内参。采用2-ΔΔCt法计算miR-190、RIPK3、MLKL相对表达量。引物序列：miR-190上游5′-GATGGTTCCAGTGAGATATG-3′,下游5′-ATTATTACTGTGACCCTCGC-3′;RIPK3上游5′-AA-CTTCCTTCATCACTTGACTC-3′,下游5′-TGAAATC-AGTCCAGATCTCCCG-3′;MLKL上游5′-CAGGAAG-CTGAGTGATGTCT-3′,下游5′-GGTGAAGACTGCC-CTTCAGA-3′;GAPDH上游5′-ATTGAGACCAAGTACGCTGTGAGTATCA-3′,下游5′-TACTGACTCGC-TCTTCACAGGCCTACAT-3′。

1.6 CCK-8测神经元细胞活力

取各组神经元细胞按每孔1×104个接种于96孔板，于缺氧1、3、5 h后取出，加入CCK-8试剂培养1 h后，运用酶标仪检测波长在450 nm处的光密度(A)值。

1.7流式细胞术检测神经元凋亡

取各组神经元细胞接种于6孔板中，培养24 h后，离心10 min, 1 500 r/min,离心半径为10 cm,收集细胞，加入荧光素-5-异硫氰酸盐(FITC)标记的膜联蛋白(Annexin)Ⅴ和碘化丙啶(PI)染色后，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.8 Western印迹检测各组自噬相关LC3Ⅱ及AMPK通路相关AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR蛋白表达

取各组神经元细胞，离心5 min, 3 000 r/min,二喹啉甲酸(BCA)法测总蛋白浓度，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。将样品溶于5×上样缓冲液中，配制好后放入4℃冰箱内预冷，然后全部转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，再把脱脂奶粉加入，全程封闭时长为1 h。兔抗鼠LC3Ⅱ、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR一抗(稀释比例1∶500,购自沈阳万类生物科技有限公司)后，TBS-吐温20(TTBS)[20 mmol Tris-氯化氢(HCl, pH7.4),150 mmol/L氯化钠(NaCl),0.05%Tween-20]漂洗3次，每次10 min; 4℃过夜，加入辣根根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗(稀释比例1∶2 500,购自沈阳万类生物科技有限公司),37℃孵育45 min, TTBS漂洗10 min×3次，用博士德生产的二氨基联苯胺(DAB)试剂盒，在1 ml水中加A、B、C液各一滴，再加于膜上，电化学发光(ECL)试剂后凝胶成像系统(JY-Clear)分析目标条带的光密度值。

1.9统计学分析

采用GraphPad Prism8.0软件进行单因素方差分析，两组间对比采用t检验。

2、结 果

2.1各组miR-190、RIPK3、MLKL表达

对照组与miR-190-NC组miR-190、RIPK3、MLKL表达比较均无统计学意义(P>0.05);与miR-190-NC组相比，miR-190-mimic组miR-190表达明显升高，RIPK3、MLKL表达明显降低(P<0.05);与miR-190-mimic组相比，miR-190-siRNA组miR-190表达明显降低，RIPK3、MLKL表达明显升高(P<0.05)。提示miR-190 mimic与miR-190 siRNA转染成功。见表1。

2.2转染miR-190siRNA及miR-190 mimic对缺氧神经元细胞活力的影响

对照组与miR-190-NC组神经元细胞活性比较均无统计学意义(P>0.05);与miR-190-NC组相比，miR-190-mimic组神经元细胞活性明显升高(P<0.05);与miR-190-mimic组相比，miR-190-siRNA组神经元细胞活性明显降低(P<0.05)。与前一时间点比较，同组间神经元细胞活性明显降低(P<0.05)。见表1。

2.3转染miR-190mimic对缺氧神经元凋亡的影响

对照组[(12.45±1.33)%]与miR-190-NC组[(13.05±1.12)%]细胞凋亡率差异无统计学意义(P<0.05),miR-190 mimic组细胞凋亡率[(3.45±0.36)%]显著低于miR-190-NC组(P<0.05),miR-190 siRNA组细胞凋亡率[(15.26±1.33)%]显著高于miR-190 mimic组(P<0.05)。见图1。

表1各组miR-190、RIPK3、MLKL表达及不同缺氧时间对神经元细胞活力的影响

图1各组神经元凋亡

2.4转染miR-190siRNA及miR-190 mimic对缺氧神经元自噬相关蛋白及AMPK通路相关蛋白表达的影响

对照组与miR-190-NC组LC3Ⅱ、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR蛋白表达比较差异均无统计学意义(P>0.05);与miR-190-NC组相比，miR-190-mimic组LC3Ⅱ、AMPK、p-AMPK蛋白表达明显升高，mTOR、p-mTOR蛋白表达明显降低(P<0.05);与miR-190 mimic组相比，自噬抑制剂组、AMPK抑制剂组LC3Ⅱ、AMPK、p-AMPK蛋白表达明显降低，mTOR、p-mTOR蛋白表达明显升高(P<0.05),miR-190 siRNA组、自噬抑制剂组、AMPK蛋白表达抑制剂组组间比较无统计学差异(P>0.05)。与miR-190 siRNA组相比，miR-190 mimic+自噬抑制剂组及miR-190 mimic+AMPK抑制剂组LC3Ⅱ、AMPK、p-AMPK蛋白表达明显降低，mTOR、p-mTOR明显升高(P<0.05)。见表2、图2。

表2各组自噬相关蛋白及AMPK通路相关蛋白表达对比

图2各组自噬相关蛋白及AMPK通路相关蛋白表达

1～8:对照组、miR-190-NC组、miR-190 mimic组、自噬抑制剂组、AMPK抑制剂组、miR-190 mimic+自噬抑制剂组、miR-190 mimic+AMPK抑制剂组、miR-190 siRNA组

3、讨 论

缺血缺氧性脑损伤发生后会导致神经细胞活性降低甚至死亡等。研究报道，miR-190可调控缺氧复氧后心肌细胞的凋亡[9],还可调控包括膀胱癌[10]、肝癌[11]等肿瘤细胞的生物学行为。对缺氧神经细胞的影响，目前仅在吴艳荣等[12]研究中提出，黄芩苷通过上调miR-190促进神经细胞增殖及抑制炎症反应、氧化应激、细胞凋亡从而减轻缺氧导致的神经元细胞损伤。基于上述研究可知，miR-190与缺氧导致的神经元损伤联系密切。本研究提示，转染miR-190 mimic后可有效促进神经元活性并抑制神经元带凋亡，对于缺氧导致的神经元损伤具有一定的保护作用。

自噬是指细胞在自噬相关基因的调控下可清除损伤的细胞及蛋白等过程。当出现脑缺血再灌注、缺氧缺血性脑损伤等脑缺氧性相关疾病时，神经元会发生改变，影响脑细胞能量代谢从而引发相关症状产生，影响细胞功能。而自噬可清除受损的细胞，从而维持细胞稳态。在神经元受损后，自噬被激活可能利于细胞维持自身稳态，减少损伤，从而发挥神经保护作用。多位学者证实，自噬在多种疾病中具有保护作用[13,14]。LC3参与自噬过程的始末，其中以LC3Ⅱ最为常见，因此常运用其衡量自噬的发生[15]。本实验转染miR-190mimic后LC3Ⅱ表达升高，转染miR-190siRNA后与给予自噬抑制剂干预后的水平较为接近，提示miR-190mimic可能通过其调控LC3Ⅱ表达调控自噬。为了证实这一结论，本实验运用miR-190mimic联合了自噬抑制剂后发现，miR-190mimic可逆转由自噬抑制剂抑制的LC3Ⅱ表达，但其促进自噬的作用较只转染miR-190 mimic后削弱。这提示，转染miR-190mimic后可通过提高LC3Ⅱ表达，促进自噬，改善神经元损伤。陈艾等[8]研究提出，在缺氧诱导的神经元损伤中，通过激活自噬后可有效缓解神经元损伤。本结果与上述研究结果相似。因此推测，转染miR-190 mimic后可通过调控LC3Ⅱ表达影响缺氧神经元自噬，从而发挥神经元保护作用。

程序性坏死是不同于凋亡的另一种细胞死亡方式，据文献报道[16],程序性死亡可以被一些刺激诱导，所有这些刺激会引起丝/苏氨酸蛋白激酶(RIP)3和MLKL激活。研究显示，程序性死亡的产生主要依靠活化的RIPK3和MLKL蛋白[17]。程序性死亡在机体的生长及发育中具有重要作用，与神经损伤联系密切，但其在缺氧诱导神经元损伤中的具体作用机制仍未完全了解。宋国斌[18]在研究中提出，在急性缺血缺氧再灌注损伤中，过度激活的RIP3/RIP1可导致其下游分子过度积聚，参与导致原代皮层神经元细胞程序性坏死的发生。严澎等[19]研究显示，通过抑制RIPK3可有效介导神经细胞程序性死亡，从而减少由于缺氧缺血导致的神经细胞损伤。本研究与上述研究结果相似，因此推测，转染miR-190 mimic可能通过调控RIPK3和MLKL水平改善缺氧神经元程序性死亡。激活mTOR可有效阻断自噬，激活AMPK可抑制mTOR的激活，此为经典的自噬相关通路。本实验证实了在缺氧神经元中miR-190 mimic可通过激活AMPK抑制mTOR激活自噬。陈继军等[20]研究中提出，通过调控AMPK-mTOR信号通路激活自噬，从而减轻由于缺氧缺血所致的神经元损伤。本结果与上述研究结果相似。因此推测miR-190 mimic对缺氧神经元损伤的保护作用，可能是通过调控AMPK通路，影响缺氧神经元自噬来完成的。

综上，转染miR-190 mimic后可通过调控AMPK通路激活缺氧神经元自噬，减少神经元程序性死亡及凋亡，促进神经元活性增加，从而发挥神经元保护作用。

参考文献:

3王雪如,门运政,胡淼,等.AMPK介导线粒体融合与裂变在抑制P2X7受体抗神经元缺氧/复氧损伤中的作用[J].蚌埠医学院学报,2020;45(6):714-9.

8陈艾,周晖,童煜,等.脑源性神经生长因子经自噬对胚鼠神经元缺氧损伤的保护作用[J].实用儿科临床杂志,2012;27(17):1351-4.

12吴艳荣,刘光伟,刘全忠,等.黄芩苷通过上调miR-190表达缓解缺氧缺糖对神经细胞损伤的研究[J].中草药,2021;52(10):3009-17.

13杨巧薇,倪环宇,吴丽,等.香菇多糖调控自噬对高糖诱导HUVEC损伤的保护作用及机制[J].中国药理学通报,2022;38(8):1182-9.

14潘秀虹,康红丽,巩奇明,等.雷帕霉素通过调控海马组织富含半胱氨酸61和自噬对狼疮小鼠认知功能的保护作用研究[J].中华风湿病学杂志,2022;26(6):379-86,C6-1.

16黄培昆.RIP1/RIP3/MLKL通路介导的程序性细胞坏死在小鼠脑出血的作用研究[D].福州:福建医科大学,2017.

18宋国斌.缺血缺氧后过度激活的RIP3/RIP1诱发大鼠神经元细胞程序性坏死的发生的作用机制研究[D].武汉:华中科技大学,2018.

19严澎,李文波,李元辉,等.过表达CHIP对缺氧/复氧诱导下RIPK3介导神经细胞程序性死亡的影响[J].卒中与神经疾病,2021;28(5):494-8.

20陈继军,王倩梅,赵鹏,等.褪黑素通过AMPK-mTOR信号通路介导的自噬在神经元缺血缺氧损伤中的作用研究[J].解放军医药杂志,2019;31(10):10-6.

基金资助:海南省自然科学青年基金项目(No.819QN370);

文章来源:林雪娟,陈丽君,李鸽,等.miR-190对缺氧神经元自噬､程序性死亡及AMPK信号转导的作用机制[J].中国老年学杂志,2024,44(20):5045-5049.