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ROCK抑制剂法舒地尔对BV2小胶质细胞极化的影响

2021-06-18 1723 上传者：管理员

关键词：
BV2小胶质细胞
M1
M2
Rho激酶
法舒地尔
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小胶质细胞约占成年中枢神经系统细胞总量的10%～20%,是中枢神经系统(Centralnervoussystem,CNS)原位免疫细胞，介导中枢神经系统对感染、损伤等疾病的免疫反应[1,2]。目前研究显示小胶质细胞存在两种极化状态，即M1(经典，促炎)型和M2(替代，抗炎)型。小胶质细胞的极化受不同的条件调控，其不同的极化状态是小胶质细胞对CNS损伤具有双向作用(促进修复和加重损伤)的主要原因。CNS损伤后通过调控小胶质细胞向M2极化，有利于损伤修复[3,4]。

Rho/Rho激酶(Rho/Rho-associatedkinase,Rho/ROCK)通路主要生理功能为调节细胞骨架蛋白的合成、降解、移动和收缩，并在影响细胞分泌、增殖等方面起到重要作用。有研究提示抑制ROCK可减少神经元凋亡、抑制炎性因子分泌、促进轴突再生[5]。法舒地尔(Fasudil)为ROCK小分子抑制剂[6]。本研究探讨ROCK抑制剂法舒地尔(Fasudil)对BV2小胶质细胞极化的影响，以进一步明确ROCK抑制剂促进CNS损伤修复的作用机制。

1、材料与方法

1.1动物与试剂

BV2细胞系来自华中科技大同济医学院；Dulbecco氏改良Eagle培养基(Dulbecco’smodificationofeaglemedium,DMEM)/高糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国GIBCO公司；多聚赖氨酸(Poly-L-lysine,PLL)、4,6二联咪2苯茚二酮(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)、Fasudil试剂购自美国Sigma公司；LDH试剂盒购自南京建成生物研究所；ELISA试剂盒购自深圳达科为生物技术有限公司；兔抗Iba1购自美国Wako公司；兔抗ROCK2购自美国Santa公司；青色素3(Cyanine-3,CY3)标记羊抗兔IgG购自美国Jackson公司；MagExtractorR-mRNA纯化试剂盒购自日本Toyobo公司；RNA引物购自Invitrogenbiotechnology公司。

1.2BV2细胞复苏、培养及试验分组

液氮冻存的BV2细胞，37℃迅速复苏后用含10%胎牛血清的DMEM/高糖培养基进行培养，当细胞达到90%融合时用0.25%胰酶消化细胞，进行传代；调整BV2细胞悬液中细胞密度为1×106/mL,接种于PLL(0.1mg/mL)包被过的12孔板中，于37℃、5%CO2培养箱中进行培养24h后应用于实验；RT-PCR及ELISA检测分组为Control组、LPS(100ng/mL)+IFN-γ(20ng/mL)干预组(促进小胶质细胞向M1转化)和LPS+IFN-γ+Fasudil干预组。

1.3LDH试剂盒检测细胞培养基中LDH水平

LDH试剂盒检测Fasudil(15μg/mL)作用于BV2细胞后培养基内LDH水平，以评价Fasudil对BV2细胞毒性作用；严格按照试剂盒要求操作，反应结束室温5min后用450nm波长测定各孔吸光度；绘制标准曲线，依据标准曲线计算各孔相应的LDH水平，以0h为1,其余各时间点以与0h比值表示。

1.4RT-PCR检测CD86,TNF-α,iNOS,Arg-1、TGF-β,CD206mRNA表达水平

操作严格按照试剂盒要求进行；提取各组细胞中RNA,运用逆转录试剂盒使RNA逆转录为cDNA;应用RT-PCR检测仪检测干预12h后各组CD86,TNF-α,iNOS,Arg-1,TGF-β,CD206和GAPDH的mRNA水平，采用2-ΔΔCt法进行处理。引物序列见表1。

1.5ELISA检测细胞培养基中TNF-α,IL-1β和TGF-β水平

操作严格按照试剂盒要求进行。依据最终检测时间给予相应药物干预，同时间点终止反应，终止反应10min内用检测波长450nm,参考610nm波长测定各孔吸光度；绘制标准曲线，依据标准曲线计算各孔相应的TNF-α,IL-1β和TGF-β水平。

表1引物序列

1.6统计学处理

采用SPSS26.0统计软件；数据以均数±标准差(x¯±s)表示，2组比较采用t检验，多组间比较采用方差分析；以P<0.05为差异有统计学意义。作图采用sigmaPlot12.5软件。

2、结果

2.1BV2鉴定、ROCK2表达

免疫荧光鉴定显示，贴壁BV2细胞呈梭形，表达小胶质细胞特异性抗原Iba1(图1);经DAPI染色显示，BV2细胞100%表达小胶质细胞特异性抗原Iba1(图1);BV2细胞100%表达ROCK2(图1)。

2.2Fasudil干预后细胞形态改变及LDH水平检测

Fasudil干预后BV2细胞变大且形态变得不规则，并伴有细小的枝杈(图2)。LDH检测显示，15μg/mLFasudil干预1、3、6和12h后对BV2细胞无明显毒性作用(P>0.05)(图2)。

图1BV2的鉴定及ROCK2表达

图2Fasudil干预后细胞形态改变及LDH分泌

2.3RT-PCR检测CD86,TNF-α,iNOS,Arg-1,TGF-β,Ym1/2mRNA表达水平

RT-PCR检测小胶质细胞M1(CD86,TNF-α,iNOS)和M2(Arg-1,TGF-β,CD206)表型标记物水平显示，与Control组比较，LPS+IFN-γ(促进小胶质细胞向M1转化)干预后M1(促炎)型小胶质细胞标记物(CD86,TNF-α,iNOS)mRNA表达增加，M2(抗炎)型小胶质细胞标记物(Arg-1,TGF-β)mRNA表达减少；与LPS+IFN-γ组比较，LPS+IFN-γ+Fasudil干预后CD86,TNF-α,iNOSmRNA表达减少，Arg-1,TGF-β表达增加(P<0.05或<0.01)(图3)。3组CD206mRNA表达无明显变化(P>0.05)(图3)。即ROCK抑制剂Fasudil抑制BV2小胶质细胞向M1转化，促进其向M2转化。

2.4ELISA检测TNF-α,IL-1β和TGF-β分泌

进一步使用ELISA试剂盒检测M1型小胶质细胞炎性因子(TNF-α和IL-1β)及M2(TGF-β)分泌水平显示，与Control组比较，LPS+IFN-γ干预6h和12h后TNF-α和IL-1β分泌增加，TGF-β分泌减少；与LPS+IFN-γ组比较，LPS+IFN-γ+Fasudil干预后TNF-α和IL-1β分泌减少，TGF-β分泌增加(P<0.01)(图4)。即ROCK抑制剂Fasudil抑制BV2小胶质细胞向M1转化，促进其向M2转化。

图3不同干预组mRNA相对表达水平检测

图4不同干预组ELISA检测

3、讨论

小胶质细胞为CNS原位免疫细胞，参与中枢神经系统多种疾病进程。CNS缺血缺氧等损伤后小胶质细胞被迅速募集到损伤区域，分泌炎性因子，促进组织进一步损伤；同时活化的小胶质细胞吞噬死亡细胞及髓磷脂碎片，限制炎症病灶扩大，促进伤口愈合，分泌小胶质细胞源性神经营养因子对CNS损伤起到保护作用[1,7]。小胶质细胞对CNS损伤的双向作用与小胶质细胞极化相关。小胶质细胞具有两种极化状态：M1型(促炎型，经典激活型)和M2型(抗炎，替代激活型)两种状态。在LPS和IFN-γ刺激下小胶质细胞极化为M1型。M1(特征表型CD86,CD16,CD32和iNOS)型小胶质细胞分泌IL-1β,TNF-α,IL-6,iNOS,IL-23、CXC趋化因子配体10(CXCchemokineligand-10,CXCL10)等促炎因子。目前研究认为M1型小胶质细胞促进CNS进一步损伤。在IL-4和IL-13刺激下小胶质细胞极化为M2型。M2(特征表型Arg-1,CD204,CD206,CD163)和YM1/2分泌IL-10,TGF-β等抗炎因子。此外，M2型小胶质细胞抑制炎症反应，促进吞噬功能，从而促进CNS损伤修复[4,8,9,10]。因此，CNS损伤后促进小胶质细胞向M2极化，有利于损伤修复。

Rho/Rho激酶(Rho/Rho-associatedkinase,Rho/ROCK)广泛存在于哺乳动物组织细胞内，在神经元发育、细胞凋亡、细胞增殖、细胞骨架重组、细胞存活以及其他许多其它细胞过程中发挥重要作用[10,11,12,13]。既往研究表明，CNS缺血损伤导致Rho/ROCK活性上调，抑制ROCK可减少神经元凋亡[5,14];ROCK抑制剂Fasudil促进脊髓损伤早期运动功能恢复[15]。脑内原位定植的小胶质细胞表达ROCK2,ROCK抑制剂可抑制小胶质细胞炎性分泌[11]。

BV2小胶质细胞系多被用于体外小胶质细胞的研究[16,17]。本研究结果显示，BV2细胞表达小胶质细胞特异性抗原离子钙结合衔接分子1(IBA1),且表达ROCK2。ROCK抑制剂Fasudil促进BV2细胞吞噬功能增强，且可导致BV2细胞变大、形态不规则，并伸出多个长的枝杈。此外，Fasudil可抑制LPS和IFN-γ刺激导致的IL-1β,TNFα分泌增加，促进TGF-β分泌。上述研究结果提示Fasudil可能通过促进BV2小胶质细胞向M2极化而促进BV2吞噬功能，抑制促炎因子(IL-1β,TNFα)分泌。本研究结果显示，Fasudil干预后M1型标记物(CD86,TNF-α,iNOS)mRNA表达降低，而M2型标记物(Arg-1,TGF-β)mRNA表达增加，这证实Fasudil促进BV2小胶质细胞向M2极化。本研究进一步阐明了ROCK抑制剂对小胶质细胞的影响，为研究ROCK对CNS损伤修复提供了理论基础。

文章来源：付佩彩,叶盛,李志军,骆翔,喻志源.ROCK抑制剂法舒地尔对BV2小胶质细胞极化的影响[J].卒中与神经疾病,2021,28(03):258-262.