神经损伤及以阿尔茨海默病（Alzheimer's disease,AD）为代表的神经退行性疾病不仅严重影响患者生活质量，也给家庭带来巨大的经济负担。由于机体内神经前体细胞数量有限，成熟的神经系统缺少前体细胞产生新的神经元和胶质细胞，因此损伤后的神经很难自我恢复，目前传统的治疗方法（如外科干预、物理刺激等）对神经功能性恢复作用十分有限[1]。干细胞治疗这一方式的提出为神经系统的修复和再生带来新的希望。目前以干细胞为基础的治疗方式已经取得了一定的进展。干细胞移植能够有效促进神经细胞功能修复及组织再生，其中，牙髓干细胞（dental pulp stem cell,DPSC）是在胚胎发育过程中从神经嵴分化而来，其在一定条件下可以被诱导成神经干细胞等神经细胞。DPSCs移植到大脑损伤区域后，可分化为神经胶质细胞和神经元，体视学可见小脑分子层、颗粒层及白质体积明显增加，浦肯野细胞的退化被遏制，为神经系统疾病的治疗提供可能[2]。

淫羊藿苷（Icariin,ICA）是从传统中草药小檗科淫羊藿苷属植物——淫羊藿的茎叶中提取，为黄酮类物质，具有抗凋亡、抗炎、抗氧化等作用。ICA可以促进间充质干细胞的增殖及成骨向分化。有关神经干细胞（neural stem cell,NSC）的研究报道，ICA可促进NSCs的增殖和分化[3]，也有研究表明，ICA可促进间充质干细胞的神经向分化作用[4,5]。目前ICA对牙源性干细胞的影响罕见报道，因此，本研究拟探讨ICA在体外环境下对DPSCs神经向分化的作用。

1、材料与方法

1.1主要试剂和材料

ICA（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），α-MEM、Neurobasal-A培养基（美国Gibco公司），B-27 Supplement、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）（美国Invitrogen公司），胎牛血清（江苏四季青生物科技有限公司），胰蛋白酶、I型胶原酶、Dispase（北京索莱宝科技有限公司），RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制剂、BCA蛋白浓度测定试剂盒（江苏碧云天高新技术有限公司），PVDF膜（美国Millipore公司），抗Nestin抗体、抗βⅢ-tubulin、抗NSE、抗β-actin、小鼠Alexa Fluor 488二抗（美国Santa Cruz公司），表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）、CD29、Stro-1、CD45、CD106（美国BD公司）。

1.2实验方法

1.2.1 DPSCs分离培养和神经向诱导分化

本研究经首都医科大学宣武医院伦理委员会批准（批准号：临研审[2021]004号），且所有患者知情同意。收集首都医科大学宣武医院口腔科门诊拔除的健康无龋坏第三磨牙，按照参考文献[5]进行细胞提取与培养：于无菌条件下劈开牙冠，取出牙髓组织，超净台上剪碎牙髓组织后，配置混合酶消化液（3 g/LⅠ型胶原酶、4 g/L dispase）于37℃下消化1 h至组织成絮状，用70μmol细胞筛收集细胞，1 100 r/min离心5 min后弃上清，使用α-MEM培养基，添加20%胎牛血清和1%双抗重悬后接种于T25培养瓶中，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养。观察细胞生长状况至80%～90%融合时进行传代培养，取P3～P5代细胞用于后续实验。使用流式细胞仪检测第3代细胞表面标志物抗原CD29、Stro-1、CD45、CD106的表达。

配制神经向诱导培养基[6](NSC优势培养基Neurobasal-A添加2%B-27 Supplement、20μg/L bFGF、20μg/L EGF、2 mmol/L谷氨酰胺、100 IU/mL青链霉素）用于后续诱导DPSCs细胞神经向分化。

1.2.2 CCK-8法检测细胞活力

DPSCs接种于96孔板中，细胞密度为1×103个/孔，待细胞贴壁后，加入不同浓度的ICA(0.01μmol、0.10μmol、1.00μmol、10.00μmol）培养48 h，每组设置3个复孔。检测前吸弃培养基，每孔加入100μL新配置的CCK-8反应液后于37℃孵育4 h，使用酶标仪于450 nm波长处测定OD值，以不加入ICA的单纯培养基培养DPSCs为对照组，以无细胞的单纯培养基为空白组。细胞存活率[7]=(OD实验组-OD空白组）/（OD对照组-OD空白组）×100%，筛选出最佳促增殖浓度的ICA用于后续实验。

1.2.3细胞形态学观察

接种DPSCs于低吸附细胞培养板中，细胞密度为1×105个/孔，用含0.10μmol ICA(ICA组）的神经向诱导培养基培养细胞，以不加ICA的神经诱导培养基为对照组（Con组），每组设置3个复孔。每3天进行1次半换液，诱导培养7 d，每天于光学显微镜下观察各组细胞的形态变化，并统计细胞直径大小。

1.2.4细胞免疫荧光染色

于诱导分化的第7天，吸弃各组培养基，制作各组细胞玻片。室温下使用4%多聚甲醛固定细胞玻片30 min,PBS洗涤5次。使用0.2%Triton X-100通透20 min,5%BSA封闭1 h后，加入一抗Nestin(1∶500）于4℃孵育过夜。PBS洗涤5次后，加入小鼠Alexa Fluor 488二抗室温避光孵育1 h，细胞核用DAPI复染3 min后洗涤，抗淬灭封片剂封片，于荧光显微镜下进行观察并拍照。每组实验重复3次。

1.2.5 Western blotting检测Nestin、βⅢ-tubulin及NSE蛋白表达

于诱导分化的第7天离心收集各组细胞于EP管中用于Western blotting检测。使用RIPA裂解液于冰上裂解各组细胞，4℃离心收集上清液，BCA标准蛋白定量测定蛋白浓度。制备蛋白变性样品，将煮沸后的样品进行SDS-PAGE电泳分离，转移至PVDF膜上，洗去多余电转液，5%脱脂奶粉封闭1 h。分别加入βⅢ-tubulin(1∶1 000）、Nestin(1∶1 000）、NES(1∶1 000）、β-actin(1∶1 000）一抗于4℃孵育过夜。TBST分别洗膜3次，每次洗膜5 min后加入对应的二抗于室温下孵育2 h，以β-actin为内参，TBST洗膜后加入ECL化学发光试剂进行曝光并拍照。每组实验重复3次。

1.3统计学方法

数据分析采用Graphpad 5.0和SPSS 19.0统计软件。计量资料以均数±标准差表示，多组比较用方差分析，进一步两两比较用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 DPSCs的原代培养及鉴定

剪碎牙髓组织块后，酶解法培养3～5 d后，于显微镜下可见培养瓶内有少量细胞爬出，细胞形态呈长梭形，培养至第10天时，可见局部有大量细胞呈旋涡状排列。培养20 d左右细胞融合达80%～90%融合，使用胰酶进行传代培养。DPSCs传至第3代时，细胞在培养瓶内分布均匀，形态呈梭形，互相接触，呈放射状紧密联系及排列，为典型的成纤维细胞形态（见图1）。流式细胞术检测结果显示：间充质干细胞表面标志物CD29、Stro-1为阳性表达，阳性表达率分别为95.77%和97.45%；造血干细胞表面标志物CD45、CD106为阴性表达，阴性表达率分别为1.36%和1.30%（见图2），表明DPSCs分离成功，可用于后续实验。

图1 DPSCs原代培养  

图2 DPSCs流式细胞术检测  

2.2不同浓度ICA组DPSCs相对活力的比较

加入不同浓度的ICA(0.01μmol、0.10μmol、1.00μmol、10.00μmol）培养细胞48 h后检测DPSCs相对活力，CCK-8法实验结果显示，各组细胞存活率分别为（99.39±7.83）%、（110.11+3.72）%、（121.50±13.55）%、（119.32±14.25）%、（112.48±6.41）%。不同浓度ICA组的DPSCs相对活力值比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=3.718,P=0.027）（见图3）。选取DPSCs相对活力值最高的0.10μmol ICA用于后续神经向诱导实验。

图3不同浓度ICA组DPSCs相对活力比较 

2.3 ICA促进DPSCs来源的神经球形成

神经向诱导分化后，细胞形态发生了很大的变化，原本为长梭形的DPSCs胞体缩小成圆形，细胞有成球生长趋势，呈现出类似于神经细胞的形态。随着培养时间的增加，细胞不断聚集形成神经球样结构。加入0.10μmol ICA后，光学显微镜下可见ICA组神经球直径不断增大，说明ICA的加入有助于细胞的聚集成球（见图4）。对各组形成的神经球直径进行统计，对照组（Con组）与ICA组神经球直径分别为（67.57±21.34）、（137.14±44.98）μm。ICA组与Con组神经球直径比较，经t检验，差异有统计学意义（t=3.697,P=0.003）。ICA组神经球直径较Con组增大（P<0.05）（见图5）。

2.4 ICA促进DPSCs来源的神经球Nestin免疫荧光表达

Nestin荧光染色结果显示，两组细胞形态均呈球形，Nestin呈阳性表达，但与Con组比较，ICA组可见神经球样结构直径增大，与光学显微镜下观察结果一致（见图6）。Con组与ICA组Nestin荧光强度相对值分别为（0.43±0.08）、（0.82±0.07），经t检验，差异有统计学意义（t=6.956,P=0.000）。ICA组Nestin荧光强度增加（P<0.05）（见图7）。

图4光学显微镜下观察神经球的形成  

图5神经球直径大小比较  

图6 Nestin细胞免疫荧光染色  

图7荧光强度相对值比较  

2.5 ICA组与Con组各神经相关蛋白Nestin、βⅢ-tubulin、NSE表达的比较

Western blotting检测结果显示，各组细胞中神经相关蛋白Nestin、βⅢ-tubulin、NSE的表达见图8。Con组和ICA组Nestin蛋白相对表达量分别为（0.45±0.05）、（0.71±0.06），两组比较，经t检验，差异有统计学意义（t=6.057,P=0.004),ICA组Nestin蛋白相对表达量升高。Con组和ICA组βⅢ-tubulin蛋白相对表达量分别为（0.56±0.06）、（0.75±0.04），两组比较，经t检验，差异有统计学意义（t=4.484,P=0.011),ICA组βⅢ-tubulin蛋白相对表达量升高。Con组和ICA组NSE蛋白相对表达量分别为（0.45±0.04）、（0.57±0.03），两组比较，经t检验，差异有统计学意义（t=4.699,P=0.009),ICA组NSE蛋白相对表达量升高（见图9）。

图8 ICA组与Con组各神经相关蛋白的表达 

3、讨论

创伤、神经退行性疾病等可导致受损区域的神经元损伤、变性甚至死亡，成熟的神经元在受损后不能再生。传统治疗通常采用外科手术干预配合药物、康复治疗等，预后恢复受限，不能从根本上解决神经元缺失的问题，严重影响患者身体健康和生活质量[8]。干细胞是一类非特化细胞，具有自我更新及分化为多种细胞的潜能，干细胞移植是目前治疗神经损伤最有前途的治疗措施，其可以在损伤部位增殖、分化形成神经元和/或胶质细胞等，促进功能性恢复。NSCs在神经损伤的细胞治疗中具有重要地位，其可以从大脑海马下区或脊髓中央管分离得到。NSCs具有自我更新及分化为所有神经外胚层细胞的能力，可代替损伤区的受损细胞[9]，但其细胞数量少、取材困难，难以满足临床和研究需要。间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）移植后可发挥多潜能分化作用，在适宜的诱导条件下可分化为NSCs或神经元等，还可通过自分泌及旁分泌效应与内环境中其他细胞相互作用，促进神经损伤的再生与修复[10]。

图9 ICA组与Con组各神经相关蛋白相对表达量比较  

与骨髓间充质干细胞（bone marrow stem cell,BMSC）及脂肪来源的间充质干细胞（adipose-derived stem cell,ADSC）比较，DPSCs在临床获取较易，可从临床常规拔除的牙齿（智齿、正畸减数牙、脱落乳牙等）中提取培养，临床标本数量充足且伦理学争议少，因此成为干细胞领域研究的热点[11]。目前研究[12]表明，在胚胎发育过程中，DPSCs来源于神经嵴细胞，与神经细胞具有同源性，自身高表达神经细胞标志物；DPSCs较BMSCs、ADSCs等具有更好的增殖率和分化活力，并且有一定的旁分泌作用，能够分泌神经营养因子，说明其具有更好的神经保护作用。DPSCs在幼稚状态下也可自发地表达早期神经元和神经嵴标志物Nestin等[13]，在神经向分化后可表达成熟的神经元标志物βⅢ-tubulin、GATA3等[14]，即这种细胞易于分化为功能性神经元，因此适合作为NSCs的替代细胞来源。

在干细胞神经向分化的诱导方式中，常常运用化学试剂、细胞因子等进行细胞诱导。近年来许多学者对传统中医药在神经损伤和修复中的作用进行了研究，其中淫羊藿是一种已广泛使用了数千年的药物，其具有补肝肾、强筋健骨等功效。ICA是从淫羊藿中提取的主要活性成分，属于黄酮类化合物，其在骨骼系统、神经系统、免疫系统等多方面具有一定的药理活性，能够促进成骨骼生长、调节免疫水平、调控机体代谢等[6]。ICA在对神经损伤（如脑损伤、脊髓损伤、缺血再灌注损伤等）及神经退行性疾病治疗与研究中取得了瞩目的进展。有研究表明，ICA对脑损伤后的大脑神经组织具有保护作用，其具有强大的抗缺血再灌注功能，通过改善血流变化、抑制小胶质细胞激活，发挥脑保护作用[15]。ZHU等[16]研究表明，ICA在脑损伤后可以抑制脂质过氧化与炎症反应，通过抑制相关凋亡通路如Caspase通路，显著降低神经元凋亡比例，从而促进神经功能恢复。在进一步脊髓损伤的研究中，LI等[17,18]证实了ICA能够抑制脊髓损伤后促炎症细胞因子及中性粒细胞的表达，显著降低TNF-α、IL-1β的水平；同时，ICA还可提高机体的抗氧化酶SOD活性，抑制脊髓损伤后自由基激增，降低氧化应激产物MDA等水平。ICA可以维持神经系统稳态，维持神经元的正常形态与功能，促进神经干细胞的增殖与神经球的形成，从而对神经退行性疾病发挥保护作用。有研究报道，在AD和帕金森综合征（Parkinson's syndrome,PD）这2种以神经元退行性病变为特征的疾病中，ICA可通过多种途径抑制神经元凋亡，对神经元起保护作用[19]。

ICA在神经系统中的机制与应用是目前神经科学的前沿，其神经保护机制尚不明确。最新研究提示，ICA可能通过调控干细胞的增殖与分化等发挥其相关作用[20]。体外研究表明，ICA可促进NSCs的增殖及神经球的形成，并且其相关机制可能与激活ERK/MAPK通路或Wnt通路相关[21]。动物实验表明，ICA可以促进内源性干细胞向神经细胞分化，改善神经损伤大鼠的神经病理改变[22]。此外，ICA也可以促进MSCs的神经向分化，病理改变促进ADSCs的增殖，诱导ADSCs的神经向分化，上调施旺细胞标志物S100、P75、GDNF等[23]。因此可推测，ICA可能具有调控牙源性干细胞DPSCs分化与增殖的作用，并可能促进其神经向分化。既往研究表明，0.01～10.00μmol的ICA可显著促进MSCs细胞增殖，其中促进效果最佳的浓度为0.10μmol[24]。WEI等[25]针对ICA对大鼠来源的BMSCs(rBMSCs）的研究表明，ICA(0.10μmol）在1～14 d内可显著提高rBMSCs增殖活力，但当ICA浓度超过20.00μmol时，对rBMSCs增殖活力则具有一定的抑制作用[26]。同时研究表明，当ICA浓度过低时，例如0.001μmol，则对增殖无明显作用[27]。总体上认为ICA对细胞增殖活力具有促进作用的浓度范围为0.01～10.00μmol。本研究首先探索不同浓度的ICA对DPSCs增殖活力的影响，结果表明，0.10μmol ICA可显著促进DPSCs的增殖活力，因此后续实验中使用0.10μmol ICA进行其对DPSCs神经向分化的研究。本实验在DPSCs神经向诱导的基础上加入ICA，结果显示ICA组诱导形成的神经球直径明显增加。神经球是由于细胞不断自我更新和球聚集产生的，首先形成一些小的神经球，然后每个神经球通过细胞分裂与其他细胞团聚集形成大的神经球，神经球直径的大小反映了神经球的增殖潜能[28]，说明ICA可以促进DPSCs来源的神经球形成。本实验进一步采用细胞免疫荧光染色及Western blotting检测神经向分化相关蛋白Nestin、βⅢ-tubulin、NSE的表达，结果显示，加入ICAs后，神经各相关蛋白相对表达量均较对照组有明显升高，说明ICA可以促进DPSCs的神经向分化。

综上所述，ICA可促进DPSCs的增殖，并且0.10μmol ICA的促增殖效果最佳。ICA对DPSCs神经向分化的结果表明，ICA能够促进DPSCs成球，促进其神经向分化各相关蛋白的表达。本研究结果表明，ICA对DPSCs的神经向分化具有一定的促进作用，为神经损伤的修复治疗提供一种新的思路和初步的探索。

基金资助:国家自然科学基金(No:62005185,No:62105226);北京市医院管理中心“青苗”计划专项经费资助(No:QML20230809);宣武医院国自然青年培育项目(No:QNPY2020025);

文章来源:张欣然,李昊天,杨文文等.淫羊藿苷对人牙髓干细胞神经向分化作用的初步研究[J].中国现代医学杂志,2023,33(15):46-52.