阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）是常见的神经系统退行性疾病，老年斑和神经元纤维缠结是AD的重要病理特征。老年斑的主要组成物质是β淀粉样蛋白（Amyloid-beta,Aβ）。胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1）可以对AD产生有益的作用。最新研究发现利拉鲁肽可以通过减少白细胞介素（interleukin,IL)-1β减少星形胶质细胞的激活，减缓AD患者的病情。二肽基肽酶-4抑制剂（dipeptidyl peptidase-4 inhibitor,DPP-4i）能明显抑制IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF)-α等炎症因子的表达，但是否也可以作用于AD，目前并不清楚。国外最新的研究认为利格列汀不穿过血脑屏障，但可在外周抑制DPP-4，从而增加循环中GLP-1的水平，而GLP-1可穿过血脑屏障提供神经保护作用[1]。除了增加循环中GLP-1水平，利格列汀还可以减少海马中的可溶性Aβ1-42、糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3 beta,GSK-3β）、TNF-α、IL-1β、IL-6、乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase,AChE）水平及氧化和亚硝化应激生物标志物的应激水平[1]，但是该研究并没有明确利格列汀组与多奈派齐组疗效差别，也没有明确其它DDP-4i是否有类似作用。本研究旨在评估不同浓度的西格列汀在Aβ1-42诱导的AD大鼠模型中的作用，同时与多奈派齐组进行比较。

1、材料与方法

1.1主要试剂与材料

72只雄性Wistar白化大鼠，体质量250～300 g,SPF级别，由湖北省实验动物研究中心提供。许可证号：SCXK（鄂）2020-0018。大鼠在标准实验室条件下饲养。主要试剂：Aβ1-42(E-EL-R1402c）、IL-6(E-EL-R0015c）、IL-1β(E-EL-R0012c）、TNF-α(E-EL-R2856c）均购于Elabscience公司，GLP-1(ER0996）、GSK-3β(ER0060）购于FineTest公司，过氧化氢酶（Catalase,CAT）检测试剂盒（A007-1-1）、AChE(A024-1-1）购于南京建成生物工程研究所，鼠Aβ1-42(A275149）、胰岛素受体底物-1(IRS-1)(s307）购于Aladdin，聚丙烯酰胺试剂盒（PG112）购于上海雅酶生物医药科技有限公司；主要药品：西格列汀（100 mg×7片，捷诺维公司），多奈哌齐（5 mg×7片，卫材公司）；主要设备：离心机（MCR-88-8,ESCO），酶标仪（ST-360，上海科华），正置光学显微镜（NIKON ECLIPSE E100，日本尼康）。

1.2方法

1.2.1模型制备、分组及给药方案

将4μg Aβ1-42溶解于4μL人工脑脊液中，配置成1μg/μL的稀释液，立体定向双侧脑室（前囟后3.6 mm，旁开2.4 mm，深度2.8 mm）注入[1]制备AD大鼠模型。将大鼠随机分为9组，每组8只。第I组（对照组）：口服饮用水8周；第II组（假手术）：第1天，大鼠双侧脑室内各输注4μL人工脑脊液；第III组（Aβ1-42）：第1天大鼠大脑双侧脑室内各输注4μg Aβ1-42；第IV、V、VI组（Aβ1-42+西格列汀）：第1天，大鼠双侧海马输注4μg Aβ1-42，然后口服不同剂量的西格列汀8周（第IV、V、VI组西格列汀的剂量分别为1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg）；第VII组（西格列汀）：口服西格列汀（1 mg/kg)8周；第VIII组（Aβ1-42+多奈哌齐）：第1天，大鼠双侧脑室内输注4μg Aβ1-42，然后口服多奈哌齐（1 mg/kg)8周；第IX组（多奈哌齐）：口服多奈哌齐（1 mg/kg)8周。

1.2.2 Morris水迷宫测试

用于评估大鼠记忆功能。水池分为4个象限，设定8个大鼠下水的方位，每天每只大鼠进行4次实验，前2次和后2次平台分别放在2个不同的位置，记录大鼠找到平台的时间，若超过1 min没有找到平台，则引导大鼠到平台，并让大鼠在平台上停留15 s。

1.2.3样本制备

水迷宫实验结束后，处死所有大鼠收集脑组织（海马）。每组随机选择3个脑组织保存在4%福尔马林中进行组织病理学分析，其余海马组织匀浆、取上清，-80℃保存待测。

1.2.4海马GLP-1、可溶性Aβ1-42、GSK-3β水平检测

采用ELISA试剂盒，按照说明书测定。

1.2.5 IRS-1及IRS-1(s307）水平检测

采用Western Blot法。

1.2.6海马AChE水平测定

使用Ellman方法评估海马AChE水平。

1.2.7氧化和亚硝化应激生物标志物

(1)CAT测定：加入0.05 mL海马上清液和1 mL过氧化氢（0.019 M）、1.95 m L磷酸盐缓冲液（0.5 M,pH 7.0）的反应混合物，在240 nm处测量吸光度，并使用分光光度计以30 s间隔记录吸光度的变化。(2)促炎细胞因子IL-6、IL-β和TNF-α水平测定：采用ELISA试剂盒，按说明书测定。

1.2.8组织病理学分析

大鼠全脑在10%福尔马林中保存48 h，石蜡包埋，制备标准冠状切片，片厚5μm。常规HE染色、刚果红染色，光镜下观察。

1.3统计学处理

采用SPSS 26.0软件处理数据。符合正态分布以及方差齐性的计量资料以（x±s）表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用Tukey法；P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 Morris水迷宫测试结果

水迷宫测试结果显示，AD模型组（III组）大鼠的找台时间和游泳距离均高于假手术组（II组）（均P<0.001）；高剂量（3 mg/kg）西格列汀AD模型组（VI组）和多奈哌齐AD模型组（VIII组）大鼠的找台时间和游泳距离均低于其他模型组（均P<0.001）；见图1。

2.2海马GLP-1、可溶性Aβ1-42、GSK-3β、IL-6、IL-1β、TNF-α水平

检测结果显示，AD模型组（III组）大鼠海马GLP-1水平低于假手术组（II组）（P<0.01），可溶性Aβ1-42、GSK-3β、IL-6、IL-1β、TNF-α水平均高于假手术组（II组）（均P<0.01）；高剂量西格列汀AD模型组（VI组）和多奈哌齐AD模型组（VIII组）大鼠海马GLP-1水平高于其他模型组（均P<0.05），可溶性Aβ1-42、GSK-3β、IL-6、IL-1β、TNF-α水平均低于其他模型组（均P<0.05）；高剂量西格列汀AD模型组（VI组）大鼠海马的GLP-1水平高于多奈哌齐AD模型组（VIII组）、TNF-α水平低于多奈哌齐AD模型组（VIII组）（均P<0.05），见图2。

图1各组大鼠Morris水迷宫测试结果 

图2各组海马GLP-1、可溶性Aβ1-42、GSK-3β、IL-6、IL-1β、TNF-α水平比较 

2.3 IRS-1和IRS-1(s307）表达水平

Western Bolt检测结果显示，高剂量西格列汀AD模型组（VI组）和多奈哌齐AD模型组（VIII组）大鼠海马IRS-1和IRS-1(s307）表达水平低于其他模型组（均P<0.05），见图3。

2.4 CAT和AChE水平

检测结果显示，AD模型组（III组）大鼠海马CAT水平低于假手术组（II组）（P<0.001),AChE水平高于假手术组（II组）（P<0.001）；高剂量西格列汀AD模型组（VI组）和多奈哌齐AD模型组（VIII组）大鼠海马CAT水平高于各模型组（均P<0.001),AChE水平低于各模型组（均P<0.01），见图4。

2.5海马HE染色

HE染色结果显示，I、II、VII、IX组马区神经细胞正常，有突出的细胞核；AD模型组（III组）细胞浸润性斑块物质较多，提示Aβ1-42导致神经元的损伤和Aβ广泛沉积；高剂量西格列汀AD模型组（VI组）和多奈哌齐AD模型组（VIII组）浸润性物质较AD模型组（III组）减少，细胞偏向正常，细胞质嗜酸性染色较少，见图5。

2.6海马刚果红染色

刚果红染色结果显示，AD模型组（III组）有典型的淀粉样蛋白沉积，高剂量西格列汀AD模型组（VI组）和多奈哌齐AD模型组（VIII组）淀粉样蛋白沉积减少，见图6。

3、讨论

AD是一种机制复杂的神经退行性疾病。有研究认为IRS-1和IRS-1(s307）的丝氨酸磷酸化导致的脑内胰岛素抵抗与AD的发生和进展相关[2]。在大鼠海马脑室内注射Aβ1-42是一种常用的非转基因AD模型制备方法[3]。与对照组相比，模型组中AChE活性、氧化应激标志物（CAT）、亚硝酸盐水平、神经炎症细胞因子（IL-6、IL-1β和TNF-α）、GLP-1和GSK-3β水平均有明显的变化[1]。这也表明Aβ可以引起脑内胰岛素抵抗，诱发AD。DPP-4是一种可以在脑、心脏、肠等多个器官表达的II型跨膜糖蛋白。西格列汀通过抑制DPP-4增加GLP-1的活性，达到控制血糖的目的。DPP-4还存在于淋巴细胞表面，促进免疫反应。国外有研究发现在2型糖尿病中使用西格列汀能够降低血液中的IL-6、IL-1β和TNF-α水平，而海马中的TNF-α、IL-1β、IL-6可以促进AD的进展[4]。利格列汀和西格列汀并不能通过血脑屏障，但DPP-4i可延长GLP-1的血浆半衰期并增强它的外周功能。IRS-1的丝氨酸磷酸化可以作用于中枢神经系统的GSK-3β和GLP-1，导致脑内的胰岛素抵抗，促进AD进展[4]。

Aβ1-42肽的脑室内输注降低了大鼠中GLP-1的水平。由于IRS-1的丝氨酸磷酸化，脑胰岛素抵抗导致神经变性[4,5]，通过使用GLP-1类似物治疗可以改善这种情况[5]。AD的体内模型中，脑中GLP-1水平的增加会下调GSK-3β和Tau磷酸化[6]。GSK-3β可影响Aβ的沉积和Tau的磷酸化，在AD中起着非常重要的作用[7]。研究发现西格列汀组海马中GLP-1水平比多奈派齐组海马中GLP-1水平高。

图3各组IRS-1和IRS-1(s307）蛋白表达水平  

图4各组CAT和AChE水平比较 

图5各组大鼠海马HE染色（标尺=100μm)   

图6各组大鼠海马刚果红染色（标尺=100μm)   

Aβ蛋白产生的原因，可能是由于淀粉样蛋白通路中β和γ分泌酶对β-淀粉样前体蛋白（APP）进行蛋白水解，或者是由于Aβ降解蛋白酶如胰岛素降解酶（IDE）对Aβ的降解减少[8]。Aβ的积累导致进行性神经损伤，特别是海马神经损伤，最终引起AD患者的突触功能障碍和记忆障碍[9,10]。

本研究中，高剂量西格列汀模型组和多奈哌齐模型组的IRS-1和IRS-1(s307）的水平低于其他模型组（均P<0.05）。既往有研究表明海马中Aβ1-42水平的增加引起307位IRS-1的丝氨酸磷酸化，从而导致神经变性[9]。Akt蛋白或PI3K/Akt途径活性的增加会导致GSK-3β活性的抑制[11,12]。

AChE主要负责将神经递质乙酰胆碱降解为乙酸盐和胆碱，引起胆碱功能缺陷，导致AD患者认知能力下降[13]。AD中Aβ可以增加AChE活性，损伤胆碱能神经传递[14]。在大鼠脑室注射Aβ1-42引起海马AChE活性显著增强[15]，本研究证实给予西格列汀治疗后，AChE活性明显下降。

有研究表明促炎细胞因子如IL-6、IL-1β和TNF-α在AD患者血清和脑组织中的表达增强[16,17]，并且与AD的胆碱能功能障碍和记忆障碍相关。本研究中，大鼠海马中注射Aβ1-42后，IL-6、IL-1β和TNF-α的水平明显升高。既往研究表明IL-6、IL-1β和TNF-α可以激活核因子κB(NF-κB），增强神经元中的β-位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE-1酶）的活性，使Aβ增多[18]。因此，降低促炎细胞因子水平可能会减少神经元中BACE-1酶的表达，从而降低神经元中Aβ的水平。本研究中，高剂量西格列汀模型组中细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平下降，表明西格列汀可以抑制这3种细胞因子水平，而多奈哌齐模型组中只有IL-6和IL-1β水平下降。

对Aβ诱导的AD大鼠的海马神经元行HE组织病理学分析，结果显示组织切片中嗜酸性染色细胞质增多、神经元萎缩、细胞核固缩[19]。刚果红染色可以确认Aβ沉积，研究发现Aβ诱导的大鼠海马中有高密度的红色染色，提示Aβ沉积[20,21,22,23]。本研究中，我们通过HE和刚果红染色分析了不同浓度的西格列汀对Aβ1-42诱导的AD大鼠海马神经组织病理学切片，结果提示西格列汀治疗8周会增加大脑中GLP-1的水平，从而减轻AD的病理特征，改变程度与西格列汀的给药浓度有关。

GSK-3β信号通路可以调控AD的发展。本研究中，高剂量西格列汀和多奈哌齐组海马GSK-3β低于其他模型组（P<0.05），但2组间差异无统计学意义。虽然DDPi不能通过血脑屏障，但是可以通过减少GSK-3β而作用于脑内。分析国外研究数据也表明利格列汀和多奈哌齐一样可以降低GSK-3β水平[1]。本研究表明西格列汀能够降低IRS-1磷酸化、减少GSK-3β、增加GLP-1水平、抑制AChE活性、减少CAT，从而降低Aβ1-42的沉积，同时降低IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

除了GLP-1的水平外，从细胞因子水平和病理切片结果上看，西格列汀和利格列汀对AD都有一定的作用，但与多奈派齐相比并无绝对优势。西格列汀组脑组织中TNF-α浓度更低，是否对AD的进展有作用，仍需进一步研究。本研究的不足在于观察时间短，多奈派齐与西格列汀的作用差别还需要长期观察。

4、结论

综上所述，本研究证明通过口服8周西格列汀可减轻大脑胰岛素抵抗，减少海马神经元的AD样改变，脑胰岛素抵抗与AD的发生和进展存在关联。西格列汀可以通过抑制GSK-3β信号通路达到治疗AD的作用，因此西格列汀可能成为治疗AD潜在药物之一。高剂量（3 mg/kg）西格列汀模型组和多奈哌齐（1 mg/kg）模型组有相似的疗效和病理改变，但高剂量西格列汀模型脑组织中TNF-α水平更低、GLP-1水平更高，其中的临床意义有待进一步的研究。临床常用的西格列汀为100 mg，而多奈哌齐的剂量为10 mg，远高于实验的剂效比，先期进行糖尿病合并AD的临床研究有较大的意义。本研究的创新点在于揭示了西格列汀对AD的作用机制，比较了西格列汀与多奈派齐的短期疗效。

基金资助:广东省医学科学技术研究基金项目(基于GSK-3β信号通路探索西格列汀调控阿尔茨海默病机制,No.A2022550);

文章来源:刘潺潺,王钟情,张立波,等.西格列汀通过糖原合酶激酶-3β通路调控阿尔茨海默病[J].神经损伤与功能重建,2024,19(04):187-191+226.