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类风湿性关节炎差异表达HSP90客户蛋白基因采用全基因组芯片筛选的价值研究

2020-08-27 266 上传者：管理员

摘要：目的用全基因组芯片筛选出在类风湿性关节炎发生发展中差异表达热休克蛋白90(HSP90)客户蛋白的基因。方法按照体重将SD大鼠随机分为2组:正常对照组和模型组,每组3只。模型组大鼠左后足皮下注射弗氏完全佐剂0.1mL制备关节炎模型,正常对照组予以等量0.9%NaCl。造模后第21天,深度麻醉下取2组大鼠滑膜组织,用Arraystar大鼠全基因组芯片来检测差异表达的信使核糖核酸(mRNA),再根据已知的942个HSP90的客户蛋白进一步筛选对应的mRNA。结果筛选出85个与佐剂性关节炎发生发展有关的差异表达HSP90客户蛋白的mRNA,其中上调53个,倍数最高的是白细胞介素-1β(IL-1β);下调32个,倍数最高的是莫霍克同源框(MKX)。结论在HSP90的客户蛋白中,IL-1βmRNA等53个上调的mRNA和MKX等32个下调的mRNA与佐剂性关节炎发生发展密切相关。

关键词：
佐剂性关节炎
基因芯片
客户蛋白
滑膜
热休克蛋白90
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类风湿性关节炎(RA)的发病机制尚未得到完全阐明[1]。非甾体类抗炎药和糖皮质激素等在发挥治疗作用同时也带来多种药物不良反应(ADR)[2]。热休克蛋白90(heatshockprotein,HSP90)的许多客户蛋白在RA中扮演重要角色[3]。本实验应用全基因组芯片分析研究RA中可能表达HSP90客户蛋白的基因。

材料与方法

1、材料

动物6周龄雄性SD大鼠,体重150～180g,由福建医科大学实验动物中心提供。动物许可证号:SCXK(闽)2016-0002。

药品与试剂弗氏完全佐剂(FCA),规格:每支10mg/mL,批号:Lot140522,美国Chondrex公司生产。氯仿,上海化学试剂有限公司生产。

仪器DK-8D电热恒温水槽,上海森信实验仪器有限公司产品;NanoDrop1000超微量分光光度计,美国Nanodrop公司产品。

2、实验方法

2.1分组和大鼠佐剂性关节炎(AIA)模型的建立

按照体重将大鼠随机分为2组:模型组和正常对照组,每组3只。

按参照文献[4]方法,模型组大鼠左后足皮下注射FCA0.1mL诱导关节炎发生;于第21天,检测结果表明成功建立AIA大鼠模型。正常对照组大鼠予以等量0.9%NaCl。

2.2以超微量分光光度计测定RNA浓度和纯度

于造模后第21天,每50～100mg滑膜组织加入TRIZOL试剂1mL,按参照文献[5]方法操作,用超微量分光光度计测定RNA浓度和纯度。

2.3Arraystar大鼠全基因组芯片分析基因表达谱[5]5]

芯片选择用Arraystar大鼠全基因组芯片V3.0芯片,该芯片可以描述大鼠全局mRNAs,可支持检测28287个mRNAs。

RNA标记和芯片杂交从总RNA中移除rRNA后,得到mRNA,用随机引物法将每个样品放大并转录成带荧光的cRNA,然后用RNeasyMiniKit纯化标记的cRNAs,并用超微量分光光度计检测其浓度和活性。洗涤、固定并扫描杂交芯片。

图像采集用AgilentFeatureExtraction软件(v11.0.1.1)获得芯片图,并读值,得到原始数据。用GeneSpringGXv12.1软件对原始数据进行Quantile标准化和随后的数据处理。

生物信息学分析根据表达HSP90客户蛋白的基因(Acompletelistofclientproteinsismaintainedathttp://www.picard.ch/downloads/HSP90interactors.pdf)以及差异mRNA的差异表达倍数>2、P<0.05、FDR<0.05、mRNA长度、数据库来源和基因序列,筛选出相关差异表达的mRNA。

3、统计学处理

用SPSS17.0软件包进行统计学分析,差异比较用单因素方差分析以及组间t检验,原始数据标准化后,筛选高质量探针并进一步分析。

结果

1、2组大鼠滑膜组织总RNA质量

如表1所示,所测样品OD280/260值落在1.86～1.96,OD260/230值落在1.77～2.36;28S和18SrRNA电泳条带清晰,5SrRNA条带较不明显,证实6组样品中所抽提的总RNA纯度以及完整性合格,未降解,符合基因芯片的实验要求。

2、2组大鼠滑膜组织差异表达mRNA的表达谱比较

基因表达谱芯片提示,相对于正常对照组,模型组大鼠滑膜组织中一共有4547个mRNA发生了差异倍数>2,差异有统计学意义(P<0.05)。其中,有2828个lncRNA发生了显著上调,1719个发生了显著下调。

将文献报道的936个表达HSP90的客户蛋白的基因名称逐一查找,交集有85个基因,见表2。

表1各组织样品总RNA质量测定结果

表2差异表达上调的HSP90客户蛋白基因

表2中,显著上调的有53个基因。差异倍数最高的是IL-1β,foldchange为29.55;显著下调的有32个基因,差异倍数最高的是MKX,foldchange为46.89,见表3。

表3差异表达下调的HSP90客户蛋白基因

讨论

热休克蛋白90(HSP90)可与作为其客户蛋白的新生肽链或非天然态的蛋白结合,帮助其正确折叠成具有天然构象的功能蛋白,并维持其在胞内的稳定性[6]。HSP90的客户蛋白包括配体依赖的转录因子(如类固醇激素受体)、配体非依赖的转录因子(如MyoD)、蛋白激酶(如Akt、IRAK-1、JAK1、JNK、Epidermalgrowthfactorreceptor、MAKrelatedkinase和MEK),p38MAPK、IκBα和其他(如INrf2)等。HSP90的客户蛋白在细胞的增殖、存活以及胞内信号转导等过程中都发挥着重要的作用[7]。HSP90抑制剂与HSP90结合,抑制HSP90的活性,干扰其分子伴侣功能,诱导HSP90客户蛋白的降解,从而阻断细胞信号转导通路,下调一系列炎症因子,发挥较强的抗炎作用,是一类具有开发前景的抗炎药物,HSP90可能成为重要的抗炎作用靶点。与目前的单克隆抗体药物不同之处在于,HSP90抑制剂通过抑制HSP90活性,可发挥“一靶多效”的抗炎作用。

本实验成功构建类风湿性关节炎动物模型[8,9]。基因芯片技术具有自动化程度高和高通量等优点[10]。本实验用全基因芯片探针所得mRNA表达谱显示,模型组大鼠滑膜组织存在较多数量的差异表达mRNA;并挑选出85个与实验性关节炎有关的编码HSP90客户蛋白的差异mRNA,在HSP90的客户蛋白中,IL-1βmRNA等53个上调的mRNA和MKX等32个下调的mRNA与佐剂性关节炎发生发展密切相关。

参考文献：

[8]张南文,檀青青,林厦珍,等.姜黄素衍生物FM0807抑制佐剂性关节炎血管翳的实验研究[J].中国临床药理学杂志,2017,33(24):2615-2617,2641.

[9]周玉燕,黄聪颖,汪梦圆,等.甲氨蝶呤合并山竹对佐剂关节炎大鼠的保护作用[J].中国临床药理学杂志,2019,35(10):1018-1020.

[10]谢瑞红,罗玉蓉,黄莹,等.长链非编码RNA与类风湿关节炎研究进展[J].中国临床药理学杂志,2018,34(18):2232-2234.

赖梁明,卞仪泽,林振东,马胜超,范芸,林玉滢,王洪林,陈晓乐,张南文.用全基因组芯片筛选出佐剂性关节炎大鼠滑膜组织中表达热休克蛋白90客户蛋白的基因[J].中国临床药理学杂志,2020,36(16):2463-2467.

基金:国家级大学生创新创业训练计划支持基金资助项目(201910392014)