软组织肉瘤(soft tissue sarcoma, STS)是一类高度异质性的恶性肿瘤，其发病率低，占所有成人恶性肿瘤的1%[1]。研究显示，在肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)中产生的乳酸是一种代谢废物，但越来越多的研究证明，乳酸在TME中可以协助免疫抑制细胞进而促进肿瘤进展，因此靶向乳酸代谢可能是癌症治疗的一个新方向[2,3]。另外，肿瘤突变负荷(tumor mutational burden, TMB)通过影响微环境中免疫细胞之间的联系，减弱其抗肿瘤能力而导致更差的预后[4,5]。本文从乳酸代谢基因出发，通过构建风险模型将STS样本分为高、低风险组，分析不同组内的TMB及TME中免疫差异情况。结果表明，乳酸代谢评分模型对STS的预后和TME状态评估有较高价值。

一、材料与方法

1 数据的收集与整理

从UCSC Xena(http: //xena.ucsc.edu/)的TCGA-SARC和GTEx数据库下载STS和正常脂肪、肌肉样本的转录组数据，从TCGA(https: //portal.gdc.cancer.gov/)数据库中获取STS样本的体细胞突变谱和临床信息。TCGA数据库共选取了255个STS样本和2个正常组织样本的测序数据，GTEx数据库选取911个肌肉和脂肪组织样本的测序数据及临床信息文件，并进行log2(FPKM+1)转换。从分子特征数据库Msigdb(http: //www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb)中下载284个乳酸代谢相关基因。

2 筛选差异表达的乳酸代谢相关基因

对TCGA和GTEx 2个数据进行归一化并用R“limma”包进行差异表达分析，以|logFC|≥2并且P<0.05作为差异表达基因的筛选标准。将差异表达基因再与乳酸代谢相关基因集取交集，得到STS中差异表达的乳酸代谢相关基因。为了解这些基因与STS TME相关性的潜在机制，用R语言“ggplot”“clusterprofiler”“org.Hs.eg.db”和“enrichplot”包进行基因本体(gene ontology, GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析。

3 风险预后模型建立

用R“survival”包结合临床生存时间对差异表达的乳酸代谢相关基因进行单因素比例风险回归模型(cox regression model, Cox)回归分析，筛选出与STS患者生存预后相关的基因，P<0.05被认为是预后相关基因。基因风险比(hazard ratio, HR)<1为低风险基因，表示基因表达越高，患者风险越低；HR>1为高风险基因，表示基因表达越高，患者风险越高。通过R“glmnet”包进行最小绝对收缩和选择算子(the least absolute shrinkage and selection operator, LASSO)回归，从而构建风险评分模型。各样本的风险值=基因表达与其回归系数乘积之和，按风险值中位数将STS患者分为高、低风险组。用“survival”“surviminer”和“time ROC”包绘制接收者操作特性(receiver operating characteristic, ROC)曲线。

4 基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)

将风险分组和基因表达文件整理并上传至GSEA软件(版本4.2.2),选择Msigdb数据库中的KEGG基因集作为参照，分析不同风险组中差异表达乳酸代谢基因富集的生物学信号通路。

5 计算TMB

选取TCGA-SARC队列中由VarScan平台处理的体细胞突变数据，比较高风险组和低风险组之间TMB的差异，并通过R软件“maftools”包进行可视化。

6 分析TME特征

用ESTIMATE算法计算STS高、低风险组样本中基质细胞和免疫细胞的含量，及其与风险评分的相关性。通过CIBERSOTR源代码分析22个肿瘤浸润免疫细胞在肿瘤样本中的相对含量，以及其在高、低风险组中的差异。用“limma”“GSVA”“GSEABase”“ggpubr”和“reshape2”包对高、低风险组的免疫相关功能进行差异分析。用“limma”“plyr”“reshape2”“ggplot2”和“ggpubr”包分别对高、低风险组中各免疫分子的表达进行分析，从而比较高、低风险组对免疫治疗的敏感性。

7 统计学处理

用R语言进行数据处理及可视化。2组之间的差异用Wilcoxon秩和检验或Kruskal-Wallis检验。用Cox回归模型进行单变量分析。

二、结果

1 乳酸代谢相关基因差异表达情况

在STS中，共获得29个与乳酸代谢相关的差异表达基因，包括5个上调基因[分别为主要组织相容性复合体Ⅱ类DRB1(major histocompatibility complex, class Ⅱ,DR Beta 1,HLA-DRB1)、钙网蛋白(calreticulin, CALR)、Ⅳ型胶原α1链、分泌型磷蛋白1和微粒体三酰甘油转移蛋白]和24个下调基因[分别为含卷曲螺旋螺旋卷曲螺旋螺旋结构域10、NADH泛醌氧化还原酶亚单位A11、NADH泛醌氧化还原酶亚基A13、NADH泛醌氧化还原酶B8亚基、NADH泛醌氧化还原酶亚基C2、NADH泛醌氧化还原酶亚基A9、乙酰辅酶A乙酰转移酶1、NADH泛醌氧化还原酶亚单位A10、辅酶Q8A(coenzyme Q8A,COQ8A)、丙酮酸脱氢酶E1亚基α1、NADH泛醌氧化还原酶核心亚基S7、NADH泛醌氧化还原酶核心亚基V2、血红蛋白β亚基、帕丁样磷脂酶结构域蛋白2(patatin-like phospholipase domain-containing protein 2,PNPLA2)、泛醇-细胞色素c还原酶结合蛋白、细胞色素c氧化酶亚基4I1、溶质载体家族25成员3、溶质载体家族25成员4、细胞色素c氧化酶亚基6A2、乳酸脱氢酶D、泛醌氧化还原酶复合物组装因子5、细胞色素c氧化酶组装因子、溶质载体家族19成员3、第六组磷脂酶A2]。GO功能富集分析结果显示，这29个乳酸代谢相关的差异表达基因主要生物学功能(biological process, BP)表现为有氧呼吸、前体代谢和能量的产生以及电子传递链；在细胞成分(cellular component, CC)方面，主要存在于线粒体内膜、线粒体呼吸器等；分子功能(molecular function, MF)表现为氧化还原驱动的跨膜转运体活性、电子转移活性等。KEGG通路分析表明，差异表达的乳酸代谢相关基因主要参与血管生成、糖尿病性心肌病、活性氧、帕金森病等代谢过程。

2 预后相关的乳酸代谢相关基因

单因素Cox回归分析筛选出4个与STS患者预后相关的基因，分别为HLA-DRB1、PNPLA2、CALR和COQ8A。LASSO回归的分析结果发现，上述4个基因均可纳入模型中，且具有最优效能。

3 不同分组的风险预后

将所得基因代入公式并构建风险模型，模型风险值=HLA-DRB1表达量·-0.07+PNPLA1表达量·-0.24+CALR表达量·0.32+COQ8A·-0.12。按风险值的中位值将STS患者分为高风险组(n=127)和低风险组(n=128),在TCGA队列中，ROC分析的1年、3年和5年曲线下面积(area under curve, AUC)值分别为0.67、0.67和0.63。卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier, K-M)生存分析显示，高风险组患者的总体生存时间短。患者按风险评分由低到高排列，分数越高，死亡人数越多，进一步说明高风险组患者的病死率更高。

4 GSEA富集分析

GSEA富集分析结果显示，高风险组中85条通路中的基因表达上调，P<0.05的有27条通路；P<0.01的有12条通路；主要富集在血管平滑肌收缩、神经活性配体受体相互作用和钙信号途径。低风险组中93条通路中的基因表达上调，P<0.05的有33条通路；P<0.01的有21条通路；主要富集在糖酵解及糖异生、丙酮酸代谢及氧化磷酸化通路。

5 不同分组的TMB

在高风险组样本中，前5位突变基因为肿瘤蛋白p53(tumor protein, TP53)、α地中海贫血伴智力低下综合征X连锁(alpha thalassemia retardation syndrome X-linked, ATRX)、黏蛋白16(mucin16,MUC16)、肌联蛋白(titin, TTN)、短笛突触前细胞基质蛋白(piccolo presynaptic cytomatrix protein, PCLO);在低风险样本中前5位突变基因为TP53、TTN、ATRX、视网膜母细胞瘤基因1(retinoblastoma 1,RB1)及MUC16。最常见的体细胞突变类型是错义突变。高风险组的TMB较高，与风险评分呈正相关(见图1A～B)。

6 不同分组的TME特征

TME结果分析表明，肿瘤样本免疫细胞含量与风险评分呈负相关(见图2A)。

比较高、低风险组之间的免疫细胞含量差异，结果显示，高风险组中M0、M2型巨噬细胞浸润较多，而在低风险组中CD8+ T细胞、单核细胞浸润比例较高(见图2B)。

免疫相关功能的差异分析表明，高风险组和低风险组存在差异。在高风险组中观察到更低的抗原呈递共抑制、CC趋化因子受体、检查点、细胞溶解活性、人类白细胞抗原、促炎、T细胞共抑制、T细胞共刺激、Ⅰ型和Ⅱ型干扰素(见图2C)。

通过进一步分析风险评分与免疫检查点的相关性得知，风险评分与一些免疫检查点的表达呈负相关，包括分化簇274(cluster of differentiation 274,CD274)、程序性细胞死亡1配体2(programmed cell death 1 ligand 2,PDCD1LG2)、甲型肝炎病毒细胞受体2(hepatitis A virus cellular receptor 2,HAVCR2)、T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains, TIGIT)、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4,CTLA4)、淋巴细胞活化基因3(lymphocyte-activation gene 3,LAG3)、程序性细胞死亡1(programmed cell death 1,PDCD1),见图2D。

图1 不同风险组的肿瘤突变负荷(TMB)

图2 不同风险组肿瘤微环境(TME)中免疫细胞浸润、免疫相关功能和免疫检查点

三、讨论

癌基因驱动的肿瘤代谢通过调节肿瘤细胞与TME之间的联系来影响微环境，从而限制免疫反应。肿瘤细胞通过糖酵解产生大量乳酸，使得周围环境保持酸性状态，影响免疫抑制[6]。肉瘤的微环境呈现强烈的酸化状态，酸度失衡对于其生长和转移至关重要[7]。调节性T细胞(regulatory T cells, Treg细胞)通过抑制效应T细胞功能来帮助肿瘤实现免疫逃逸，而Treg细胞生长依赖于乳酸的吸收，即靶向乳酸代谢能够降低Treg细胞对肿瘤免疫的抑制[8]。

本研究首先从STS与相应的正常肌肉、脂肪组织样本中筛选出29个差异表达的乳酸代谢相关基因，然后筛选出与STS预后相关的4个基因来构建风险模型，分别为HLA-DRB1、PNPLA1、CALR和COQ8A。有文献表明，HLA-DRB1通过将外源性抗原递呈给免疫T细胞并诱导其活化来调节免疫反应过程[9],HLA-DRB1表达水平可能与皮肤黑色素瘤TME的免疫活性有关，并可能通过改变TME状态来影响患者的预后[10]。PNPLA2的位点突变会导致其编码的三酰甘油脂肪酶(adipose triglyceride lipase, ATGL)基因功能缺陷，形成代谢性肌病。患有ATGL和激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive triglyceride lipase, HSL)基因缺陷的小鼠在1年左右易发生脂肪肉瘤，其确切机制仍需进一步研究[11,12]。CALR在非小细胞肺癌中高表达，可作为其预后的生物标志物[13]。CALR通过促进树突状细胞吞噬肿瘤细胞，从而参与效应T细胞对肿瘤细胞的消除，引起免疫应答[14]。非典型激酶COQ8A在Ⅳ级星形细胞瘤中的表达显著低于非肿瘤和低级别肿瘤样本，这可能是Ⅳ级星形细胞瘤患者预后不良的指标[15]。

研究表明，TMB越高，可能产生的新抗原越多，越易被大量T细胞识别而攻击，更有助于免疫识别和肿瘤免疫治疗[16]。本研究结果表明，TMB与风险评分呈正相关。TME的酸性状态会促进肿瘤细胞的增殖，同时乳酸抑制了免疫细胞的活性，进而促进肿瘤发展[17]。本研究结果表明，免疫细胞含量与风险评分呈负相关，在低风险组中CD8+ T细胞、单核细胞含量增高，而在高风险组T细胞含量较低，这与乳酸代谢常促进免疫抑制，进而使得肿瘤发生免疫逃逸的观点一致。ZHAO等[18]建立了肺腺癌乳酸代谢基因模型，结果提示，乳酸对TME有一定的调节作用。免疫检查点的表达作为对免疫治疗敏感的标志物，免疫检查点抑制药联合免疫细胞共同起到抗肿瘤作用[19]。本研究结果也表明，低风险组展现出较好的免疫反应能力，而高风险组中的免疫检查点表达水平均较低，对免疫检查点抑制药的治疗总体反应一般。

本文分析了STS中乳酸代谢相关基因，构建了由4个基因组成的风险模型，并发现不同风险组中TMB和TME存在差异，因此乳酸代谢相关基因标记可以作为评估STS TME状态的生物标志物，靶向乳酸代谢的治疗方法可能成为癌症治疗的有效方案。

参考文献:

[4]时姗姗,李霄,丁颖,等.肿瘤突变负荷与肿瘤浸润免疫细胞在结直肠癌预后及进展中的作用[J].临床与病理杂志,2022,42(7):1543—1551.

[17]葛威祥,严时佳,万国辉.乳酸在肿瘤微环境中的免疫调节作用[J].药学学报,2022,57(9):2570—2579.

[19]张雯婷,胡楠.基于结直肠癌微环境特征的免疫检查点抑制药联合治疗策略研究现状[J].中国临床药理学杂志,2023,39(10):1500—1504.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(81960485,82060487); 广州市科技计划市校联合基金资助项目(202201020104);

文章来源:张田田,孟莲,孙皓,等.基于乳酸代谢基因的软组织肉瘤预后模型的建立及评价[J].中国临床药理学杂志,2024,40(13):1958-1962.