乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)属于嗜肝DNA病毒科[1],主要感染人体肝脏，引发乙型肝炎。这种疾病以急性或慢性肝脏炎症损伤为主要临床表现，是一类传播性强的疾病[2-3]。据世界卫生组织统计，每年病毒性肝炎相关疾病导致约110万人死亡，以及300万例新发感染案例[4]。尽管存在乙型肝炎表面抗原(HBsAg)疫苗作为常规预防措施，并且诱导正常人群体内产生保护性抗体，从而降低乙肝病毒感染率[5],但对于已经建立慢性乙肝病毒感染的患者而言HBsAg疫苗无法引起有效的抗体应答。这可能是由于病毒抗原长期诱导的抗原特异性免疫耐受所致，因此，迫切需要一种新的治疗手段，打破慢性乙肝患者体内已建立的免疫耐受[6]。

HBV的表面蛋白PreS1位于病毒表面，与病毒入侵宿主细胞的过程密切相关[7-8],同时在乙肝病毒的组装和释放中发挥重要作用[9]。研究表明PreS1区域含有特定的抗原表位，能够被免疫系统中的T细胞和B细胞识别，从而突破免疫耐受，诱导有效、持续的免疫应答，实现功能性治愈[10-11]。2017年Bian等[12]研究发现，以PreS1区域作为疫苗在HBV耐受模型内会引起较强的CD4+T细胞免疫反应，其产生的anti-PreS1抗体能够清除血液中的PreS1抗原和HBV病毒。然而，鉴于PreS1的免疫原性较低，如何提高机体对PreS1的高效抗体应答仍是当前面临的关键问题。Wang等[13]研究表明基于铁蛋白纳米颗粒的PreS1纳米疫苗在HBV小鼠模型中会诱导高水平，高亲和力，持久的抗体应答以及免疫记忆。基于铁蛋白纳米颗粒的PreS1纳米疫苗虽展现出诱发强效免疫应答的潜力，但其高生产成本和规模化生产的复杂性可能限制其广泛应用。2022年，Han等[14]针对β冠状病毒S蛋白的RBD(受体结合域)二聚体疫苗进行了研究，发现在小鼠体内，新冠病毒的嵌合RBD二聚体抗原产生的抗体水平明显高于单体RBD所诱导的抗体水平。受此启发，推断采用PreS1二聚体蛋白可能会增强PreS1蛋白的免疫原性，进而提高其作为疫苗成分的功效。

本研究旨在构建PreS1和2PreS1蛋白的原核表达载体，表达纯化蛋白后，进一步地在小鼠体内对PreS1和2PreS1蛋白的免疫原性进行评估，结果报告如下。

1、材料与方法

1材料和试剂

C57小鼠(湖南斯莱克景达实验动物有限公司),IPTG(中国碧云天公司，批号：ST098),弗式不完全佐剂(默克集团，批号：F5506),CpG佐剂(中国泓迅生物，批号：H35715),BCA试剂盒(晶科生物，批号：E1WP2012),HisTrap(GE HealthCare,批号：11-0004-58),PrePacked Desalting Column(天地人和公司，批号：SEC00C2),山羊抗鼠IgG(美国Thermo公司),HindⅢHF(New Englan Biolabs,批号：#R3104),ECORI-HF(New England?Biolabs,批号：R3101L,BL21(DE3)感受态(生工生物工程有限公司，批号：B628414-0100)。

2重组质粒pET28a-his-PreS1和pET28a-his-2PreS1的构建

NCBI查询HBV的PreS1序列，2PreS1为PreS1序列的头尾串联，序列经过密码子优化后，交由南京金斯瑞生物科技股份有限公司合成。

3双酶切鉴定

实验组双酶切体系为：HindⅢ0.5μL,ECORI-HF 0.5μL,重组质粒(pET28a-his-PreS1和pET28a-his-2PreS1)1μg, 10×custmaster buffer 2μL,二蒸水补足至20μL;对照组双酶切体系为：重组质粒(pET28a-his-PreS1和pET28a-his-2PreS1)1μg, 6×DNA上样缓冲液，二蒸水补足至20μL;双酶切反应条件为37℃2 h。

4 PreS1和2PreS1蛋白的试表达

将pET28a-his-PreS1和pET28a-his-2PreS1质粒分别转化至BL21(DE3)感受态中，并用含有卡那霉素抗性的平板进行筛选，挑取平板上的单克隆菌落至含有卡那霉素的LB培养基中过夜培养；按1∶100的比例将活化的菌液接种至5 mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃220 rpm培养至菌液A600值为0.6～0.8。此时，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L,继续在37℃下进行4 h的诱导培养，或在16℃下过夜诱导。收集菌液后9 500 r/min(离心半径12 cm)离心5 min,去上清，用1 mL磷酸缓冲盐溶液(PBS)重悬沉淀，使用功率为100 W的超声破碎仪，设置工作模式为2 s开1 s关，持续10 min以破碎菌体。之后，将破碎后的菌液以12 000 r/min(离心半径12 cm)离心10 min,收集上清作为样品，并使用600μL PBS重新悬浮沉淀以制备样品。最后，通过SDS-PAGE检测目标蛋白的表达情况。

5 PreS1和2PreS1蛋白的纯化

将表达目标蛋白的菌株接种到含卡那霉素的培养基中，过夜培养；随后，以1∶100的比例接种至200 mL同样含卡那霉素的培养基中，在37℃和220 rpm的条件下培养，直至菌液的A600值达到0.6～0.8。此时，加入IPTG至最终浓度1 mmol/L进行诱导，其中PreS1的诱导条件为37℃、220 rpm培养4 h; 2PreS1则在16℃、200 rpm条件下过夜诱导。诱导结后，收集菌液并离心以移除上清，再使用35 mL PBS重悬沉淀。使用功率为500 W的超声破碎仪，设置5 s工作5 s休息的模式进行40 min,以破碎菌体。破碎后的上清经9 500 r/min(离心半径12 cm)离心5 min后，使用0.22μm过滤器过滤。过滤后的上清通过HisTrap镍柱进行纯化，使用不同浓度(10、20、50、100、500 mmol/L)的含咪唑洗脱液进行洗脱，每种浓度洗脱液每1 mL收集一管，共收集5管。收集的洗脱液通过SDS-PAGE制样并使用考马斯亮蓝进行染色以检测蛋白。通过BCA试剂盒测定脱盐后的蛋白浓度，并通过SDS-PAGE和Western blot技术检测纯化后的蛋白。

6重组蛋白疫苗的制备及动物免疫

将重组蛋白与弗式佐剂(Freund's Adjuvant, FIA)充分混合至完全乳化，形成乳白色的液滴。若该液滴滴入水中能形成稳定的油滴，则说明重组蛋白疫苗制备成功。对于CpG佐剂，只需将重组蛋白直接与之均匀混合，即可获得另一种形式的重组蛋白疫苗。将8周龄的C57小鼠随机分成6组，每组3只。这些小鼠分别接种含PreS1与FIA混合的疫苗、含2PreS1与FIA混合的疫苗、含PreS1与CpG佐剂混合的疫苗、含2PreS1与CpG佐剂混合的疫苗，或仅接种生理盐水作为对照。在首次免疫两周后，对小鼠再次进行同样的疫苗或生理盐水注射。到了第21 d,通过断尾采血的方法收集血液样本，并运用酶联免疫吸附测定(ELISA)技术来检测血清中PreS1抗体的水平。

7 ELISA法检测小鼠血清中PreS1抗体的水平

实验采用ELISA技术测定小鼠血清中PreS1抗体水平[12]。将纯化后的PreS1蛋白以PBS稀释至浓度2μg/mL,并在96孔板中每孔添加100μL,随后在4℃下孵育过夜以实现包被。次日，倾弃孔内溶液并使用含0.05% Tween-20的PBS(PBST)清洗已包被的96孔板三次，每次5 min。接着，在每孔中加入5%脱脂奶粉溶液100μL,于37℃下封闭1 h。之后，再次使用PBST清洗三次，每次5 min。然后，将小鼠血清经2%脱脂奶粉进行梯度稀释后，每孔加入100μL,于37℃孵育1 h。继续使用PBST洗涤三次，每次5 min。每孔随后加入100μL经过HRP标记的山羊抗鼠IgG,于37℃孵育1 h。再次使用PBST清洗三次，每次5 min。随后，向每孔加入100μL四甲基联苯胺(TMB)显色液，并在37℃、避光条件下显色15 min。最后，每孔加入100μL终止液以终止反应，并使用酶标仪在450 nm波长处测量并记录A值。

2、结 果

1重组质粒的双酶切鉴定结果

使用HindⅢ和ECORI-HF内切酶鉴定重组质粒pET28a-his-2PreS1,凝胶电泳显示双酶切后出现两条核酸条带，一条750 bp,另一条5 000 bp,这表明重组质粒构建成功(图1)。

图1重组质粒pET28a-his-2PreS1双酶切鉴定结果

2 PreS1和2PreS1重组蛋白的表达

图2A所示，在37℃下，经过4 h的IPTG诱导之后，诱导组在15 ku位置的全菌、上清和沉淀样品中均出现了目标PreS1蛋白的条带。图2B显示，在经过一夜的IPTG诱导之后，与未诱导组相比，25 ku位置的全菌和上清样品中显著表达了目标2PreS1蛋白，这证明了PreS1和2PreS1蛋白的成功表达。

3 PreS1和2PreS1重组蛋白的纯化

根据所需的蛋白表达条件，相应扩大培养并诱导目标蛋白的大量表达，随后采用镍柱进行纯化，通过收集洗脱液并使用SDS-PAGE进行分析。图3A显示，500 mmol/L的洗脱液能够成功洗脱PreS1蛋白，图3B显示，含100 mmol/L咪唑的洗脱液能够洗脱2PreS1蛋白，这表明PreS1和2PreS1蛋白纯化成功。

4 PreS1与2PreS1重组蛋白的考马斯亮蓝染色与Western blot检测

经考马斯亮蓝染色对纯化蛋白进行分析(图4A)后，观察到在15 ku和25 ku处存在尺寸合适的蛋白条带。通过使用针对His标签的抗体(图4B)和专用的PreS1抗体(图4C)进行的Western blot(WB)检测进一步确认，这两条条带分别对应于PreS1和2PreS1蛋白，验证了其成功的表达与纯化。

图2 37℃诱导4 h的PreS1(A)和16℃诱导过夜的2PreS1(B)重组蛋白的表达

M蛋白分子标准质量1未诱导细菌全菌2诱导后的细菌全菌3诱导后的细菌裂解上清液4诱导后的细菌裂解沉淀

图3重组蛋白PreS1(A)和2PreS1(B)的纯化

图4 SDS-PAGE和Western blotting检测纯化后PreS1和2PreS1重组蛋白

5重组蛋白疫苗效价评价

将纯化的重组蛋白分别与FIA或CpG佐剂配制成疫苗，随后对C57小鼠进行皮下注射。采血并利用ELISA方法检测小鼠血清中的PreS1抗体水平，具体的免疫方案见图5A和C。图5显示，不论采用CpG还是FIA作为佐剂，接种2PreS1重组蛋白疫苗的小鼠产生的PreS1抗体水平显著高于接种PreS1重组蛋白疫苗的小鼠。这一结果表明，与PreS1重组蛋白相比，2PreS1重组蛋白能够在小鼠体内激发更强烈的免疫响应。

图5小鼠免疫方案及小鼠血清中PreS1抗体水平的检测

纯化的重组蛋白与FIA(A)或者CpG佐剂(C)制成疫苗，在初次免疫的14天后二次免疫，在第21天断尾取血；用ELISA检测注射FIA佐剂的疫苗(B)和与CpG佐剂的疫苗(D)后小鼠血清中PreS1抗体的水平，灰色柱状图代表PreS1与佐剂合用，黑色柱状图代表2PreS1与佐剂合用。与PreS1与佐剂联用相比，*P<0.05。

3、讨 论

在全球范围内，感染慢性乙肝的患者数量依然庞大，这是一个亟待解决的重大卫生问题。在感染乙肝病毒后患者肝细胞核内会产生稳定的共价环状DNA,即cccDNA,这会导致感染了乙肝病毒的患者会对其产生免疫耐受，从而使病毒在体内长期潜伏，难以清除[15-16]。因此，研发新的治疗策略显得尤为重要和迫切。与常规的预防性疫苗不同，PreS1疫苗其主要目标是打破乙肝患者体内的免疫耐受状态，激发或增强机体对乙肝病毒的免疫应答，从而有望清除病毒或控制病毒复制[17-18]。然而，PreS1疫苗的研发也面临着诸多挑战，由于PreS1蛋白分子量比较小，免疫原性较低，这在一定程度上限制了临床应用。因此，如何提高PreS1疫苗的免疫原性，增强其治疗效果，是当前PreS1疫苗开发的热点和难点之一。

相较于真核表达系统在表达病毒蛋白方面的应用，原核表达系统以其高效、快速且成本相对较低廉的显著特点，在蛋白质制备领域展现出独特的优势[19]。原核表达系统利用原核生物(如大肠埃希菌)的细胞作为宿主，能够大量、快速地生产出所需的蛋白质[20]。Bian等[12]就成功地通过原核表达系统表达了PreS1蛋白，并实现了纯化。因此在本实验中，我们利用原核表达系统的这些优点，通过基因工程技术，将PreS1序列的头尾进行串联，并对序列密码子优化后，将改造后的序列插入到pET-28a原核表达载体中，利用大肠埃希菌这一宿主细胞，实现了对2PreS1蛋白的高效表达。

为了获得高质量的重组蛋白，我们对表达以及纯化条件进行了优化。优化后的表达条件为在37℃时经过4 h 1 mmol/L IPTG诱导和500 mmol/L咪唑浓度洗脱条件下，可以成功表达并纯化PreS1重组蛋白；而在16℃经过1 mmol/L IPTG过夜诱导和100 mmol/L咪唑浓度洗脱条件下，可以表达并纯化2PreS1重组蛋白。通过BCA分析与考马斯亮蓝染色，我们发现2PreS1的产量相对较低。为了评估PreS1和2PreS1的免疫原性，我们将这些蛋白与不同佐剂混合制备成疫苗，并通过皮下注射的方式给予小鼠，通过断尾取血及ELISA检测来监测小鼠血清中PreS1抗体的水平。实验结果表明，2PreS1的免疫原性显著优于PreS1,且其免疫原性的强度与所使用的佐剂类型紧密相关；与FIA佐剂配合使用时能诱导出比与CpG佐剂配合时更强烈的免疫反应，产生的PreS1抗体水平是CpG佐剂组的10倍，这可能是由于FIA佐剂在某些特定条件下更能有效地促进抗原的加工和递呈，进而刺激机体产生更高水平的抗体。值得注意的是，本研究的范围限于在小鼠模型中评估预防效果，并未探讨针对HBV的治疗性研究，这些结果为进一步开发针对HBV的治疗性疫苗提供了有益的参考和启示。

综上所述，本研究探索了PreS1及其二聚体2PreS1重组蛋白的表达与纯化方法。通过在小鼠模型中评估了它们的免疫原性，发现2PreS1蛋白相较于PreS1蛋白显示出更佳的免疫激活效果，虽然本研究的范围仅限于预防效果的评估，但这一发现为开发针对HBV的治疗性疫苗开辟了新途径。我们期待在未来的研究中能够更深入探讨PreS1疫苗的效果，为慢性乙肝患者提供更多的治疗选择。

参考文献:

[8]冯天同,朱传龙.慢性乙型肝炎治疗性疫苗的研究现状及展望[J].医学研究生学报,2021,34(2):113-118.

[15]尤红,王福生,李太生,等.慢性乙型肝炎防治指南(2022年版)[J].实用肝脏病杂志,2023,26(3):457-478.

[19]解庭波.大肠埃希菌表达系统的研究进展[J].长江大学学报(自科版)医学卷,2008(3):77-82

[20]范翠英,冯利兴,樊金玲,等.重组蛋白表达系统的研究进展[J].生物技术,2012,22(2):76-80.

基金资助:国家自然科学基金项目(No.82360390);广西自然科学基金项目(No.2022GXNSFBA035647);广西科技厅中央财政引导地方科技发展专项资金(桂科ZY21195024);

文章来源:胡明娜,韩少伟,张勇,等.2PreS1重组蛋白的表达､纯化及疫苗效果评价[J].中国病原生物学杂志,2024,19(11):1300-1304+1311.