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基于组学技术分析肺炎支原体肺炎患儿血清生物标志物

2023-12-22 222 上传者：管理员

摘要：目的:采用代谢组学分析肺炎支原体肺炎儿童血清中代谢物的变化，以期筛选出与肺炎支原体肺炎相关的潜在生物标志物，并进行相关通路分析。方法:选取2022年5月至2022年7月内蒙古医科大学附属医院儿科收治的肺炎支原体肺炎患儿为病例组，同时选取年龄匹配的健康体检儿童为对照组。采集研究对象晨起空腹静脉血2 mL,利用UPLC-Q-TOF-MS方法分析血清中代谢产物，并进行通路富集分析。结果:正、负离子模式共筛选出243种代谢物，差异代谢物有19种，与对照组相比，病例组升高6种物质，降低13种物质。通路富集分析结果显示，代谢通路包括氨基酸的生物合成、胆固醇代谢及鞘脂信号通路等。结论:儿童肺炎支原体肺炎患者与正常儿童的血清非靶向代谢组存在差异，磷脂酰胆碱对肺炎支原体肺炎具有一定的预测价值。

关键词：
代谢组学
儿童
肺炎支原体
肺炎支原体肺炎
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肺炎支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae pneumonia, MPP)主要由肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae, MP)引起，是儿童中较为常见的非典型性肺炎之一，发病率呈逐年增长的趋势。研究发现，10 %～40 %儿童社区获得性肺炎是由MP引起的[1]。MPP与细菌、病毒感染引起的呼吸道疾病症状相似，但因为MP无细胞壁，其治疗则不同，导致漏诊，延误治疗。儿童肺炎支原体肺炎若不能得到及时、有效的治疗，可能会进一步发展成为严重器质性疾病，如肾炎、脑炎等，极大程度影响患儿的生长发育和生活质量。因此快速、准确诊断MP感染意义重大。

病原体体外培养、血清学检测以及PCR技术都是MPP检测运用较多的方法。MP培养是公认的诊断MP感染的“金标准”,但该法所需周期较长，并且阳性率也低，不适合早期诊断。目前我国临床诊断MP感染所用的主要方法仍是血清学检测和PCR检测技术[2]。由于每种方法都存在局限性，这给疾病早期的诊断，尤其是药物的正确使用带来了极大的困扰。

代谢组学通过分析代谢物，用来研究生物体感染病原生物后体内的代谢物变化情况，现被广泛地应用到疾病的早期诊断，疾病标志物的筛查，疾病发生机制的探究，以及治疗疗效的评价等方面[3]。国内外对于儿童肺炎的代谢组学研究资料比较有限。本研究采用高效液相色谱质谱技术对肺炎支原体肺炎患儿血清进行代谢组学检测，为进一步了解肺炎支原体肺炎患儿血清代谢物变化的情况，同时为寻找儿童肺炎支原体肺炎的生物标志物，以及临床的早期诊断提供理论依据。

1、对象与方法

1.1对象

选取2022年5月至2022年7月内蒙古医科大学附属医院儿科收治的肺炎支原体肺炎患儿为病例组(10例),同时选取年龄匹配的健康体检儿童为对照组(10例)。所有研究对象的监护人均签署知情同意书。

1.1.1入组标准

病例组年龄为3～8岁，性别不限，符合肺炎支原体感染诊断标准以及2015年的儿童肺炎支原体肺炎诊治专家共识；对照组年龄、性别与病例组匹配。

1.1.2排除标准

(1)1个月内使用过激素，或其他影响代谢的药物。(2)肥胖，慢性腹泻等可能影响代谢的疾病或者具有先天性遗传代谢性疾病。(3)混合其他细菌感染的。

1.2方法

1.2.1样本采集

收集研究对象空腹静脉血2 mL,分离血清，取200μL上清液置于无菌EP管中，-80℃冰箱保存。

1.2.2样本处理

将上清液在4℃环境下缓慢解冻后，取适量样本加入预冷甲醇/乙腈/水溶液(2V∶2V∶1V),涡旋混合，低温超声30 min, -20℃静置10 min, 14 000 g 4℃离心20 min,取上清真空干燥，质谱分析时加入100μL乙腈水溶液(乙腈∶水=1∶1,v/v)复溶，涡旋，14 000 g 4℃离心15 min,取上清液进样分析。

1.2.3色谱-质谱分析

色谱条件：色谱柱温25℃;流速0.5 mL/min;进样量2μL;流动相组成A:水+25 mM乙酸铵+25 mM氨水，B:乙腈；梯度洗脱程序如下：0～0.5 min, 95 % B ;0.5～7min, B从95 %线性变化至65 %;7～8 min, B从65 %线性变化至40 %;8～9 min, B维持在40 % ;9～9.1 min, B从40 %线性变化至95 %; 9.1～12 min, B维持在95 %;整个分析过程中样品置于4℃自动进样器中。为避免仪器检测信号波动而造成的影响，采用随机顺序进行样本的连续分析。样本队列中插入QC样品，用于监测和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性。Q-TOF质谱条件：采用AB Triple TOF 6600质谱仪进行样本一级、二级谱图的采集。

1.2.4数据分析

采用SPSS 15.0统计软件对临床数据及实验数据进行分析。数据分析内容包括单变量及多维统计分析、差异代谢物筛选、差异代谢物KEGG通路分析等内容。

2、结果

2.1基本情况

10例病例组研究对象(男童6例，女童4例),年龄为(3.83±0.68)岁；10例对照组研究对象(男童6例，女童4例),年龄为(4.75±0.65)岁，两组间的年龄及性别差异无统计学意义。

2.2实验数据质量评价

本实验通过六项质控内容进行评价，包括仪器的稳定性、实验的重复性、数据质量的可靠性。将QC样本总离子流图(Total ion chromatogram, TIC)进行谱图重叠比较。实验结果表明各色谱峰的响应强度和保留时间基本重叠，说明在整个实验过程中仪器误差引起的变异较小。QC样本的多变量控制图，表明QC样本的波动都在正负3个标准差范围内，反映仪器的波动在正常范围内。QC样本的相对标准偏差，RSD≤30 %的Peak数目占QC样本总Peak数目的比例在80 %以上，同样反映仪器分析系统稳定性较好，数据可用于后续分析。将所有实验样本和QC样本提取得到的峰进行总体样本主成分分析(PCA)。实验结果表明正、负离子模式下QC样本紧密聚集在一起，说明实验的重复性好。对QC样本进行Pearson相关性分析，样本间的相关性系数都在0.9以上，同样说明实验重复性较好。总体样本Hotelling’s T2检验，样本均在99 %置信区间内，也反映实验重复性较好。本次实验的仪器分析系统稳定性较好，试验数据稳定可靠。在实验中获得的代谢谱差异能反映样本间自身的生物学差异。见图1、图2。

图1 QC样本TIC重叠谱图

图2总体样本的PCA分析

2.3代谢物筛选及鉴定

本实验正负离子模式合并后鉴定243种代谢物，其中正离子模式鉴定到的代谢物数量为141种，负离子模式鉴定到的代谢物数量为133种。鉴定到的所有代谢物根据其化学分类(Chemical Taxonomy)归属信息进行分类统计，计算出各类代谢物数量所占比例。见图3。

2.4差异代谢物分析正、负离子模式

共筛选出243种代谢物，OPLS-DA VIP>1和P value<0.05的差异代谢物有19种，主要为磷脂类物质，与对照组相比，病例组升高6种物质，降低13种物质。见表1。

图3鉴定的代谢物在各化学分类的数量占比

表1主要差异代谢物

2.5差异代谢物通路

通过KEGG数据库，对差异代谢物进行通路富集分析，获得其代谢通路的富集结果。代谢通路包括氨基酸的生物合成，2-氧羧酸代谢，亚麻酸新陈代谢，蛋白质消化吸收，胆固醇代谢，以及鞘脂信号通路等。见图4。

3、讨论

10 %～40 %儿童社区获得性肺炎是由肺炎支原体引起的。MP培养是公认的诊断MP感染的“金标准”,但该法所需周期较长，并且阳性率也低，不适合早期诊断。由于不能及时诊断，增加了精准治疗难度，也造成了抗生素滥用。代谢组学全面反映了生物体内代谢物变化情况，通过分析，有利于肺炎支原体肺炎血清标志物的筛查，为早诊断提供参考依据[4]。

图4 KEGG富集通路图(气泡图)

本研究结果显示，19种差异代谢物主要为脂质、类脂物质以及有机酸及其衍生物，包括磷脂酰胆碱、磷脂PC(16:0/16:0)、鞘磷脂等。肺炎患儿血清中的脂类代谢物(磷脂酰胆碱、鞘磷脂)显著降低，这与脂肪酸的代谢与肺炎有关的文献报道一致[5]。磷脂酰胆碱是肺泡表面的活性物质的主要成分，可以预防肺部感染，并有效控制炎症[6]。当机体的磷脂酰胆碱含量降低，机体抗病毒能力降低，从而易感肺炎支原体。在肺炎支原体感染过程中，鞘脂代谢也受到了扰乱。鞘磷脂类及其代谢产物参与了多种信号传导通路，在诸多病理过程中发挥重要作用。鞘磷脂代谢与病原生物的复制有关[7,8]。

机体不仅存在脂类代谢异常，代谢通路富集分析提示支原体肺炎患儿体内的氨基酸代谢也出现了异常的紊乱，即苯丙氨酸、缬氨酸含量降低。氨基酸参与多种生理或病理进程，免疫和炎症反应过程中产生的细胞因子可调节氨基酸代谢，同时氨基酸水平高低可以反映宿主对感染的免疫应答情况[9,10]。研究表明，苯丙氨酸在体内氧化生成酪氨酸，酪氨酸经转氨基作用最终代谢成延胡索酸和乙酰乙酸，两者均是含有苯环。且苯丙氨酸是一种必需氨基酸，这些含苯基的化合物主要经由肠道内的菌群代谢产生，即苯丙氨酸的代谢与肠道菌群代谢具有一定的相关性，可能肺炎支原体感染造成肠道的正常菌群代谢紊乱，使苯丙氨酸生成减少[11]。缬氨酸在检测中发现，含量也降低，但具体的机制还不太清楚。有研究报道，重症肺炎儿童血清中色氨酸比正常儿童血清中含量明显降低[12],但在本次检测中未发现色氨酸代谢有差异。

随着代谢方面的研究越来越多，代谢物在疾病中的作用得到了更大的关注[13]。众多研究表明呼吸系统疾病的发展进程与脂质代谢中的磷脂息息相关[14]。磷脂不但是肺泡表面主要活性物质成分，也是双分子层细胞膜的重要组成成分，亦是花生四烯酸等炎症介质的前体物质，更是支原体生存必需的物质来源。本研究发现磷脂酰胆碱对肺炎支原体肺炎具有一定的预测价值。

本研究所选择的病例为住院患者，采样前曾使用过药物，使得结果可能受到药物影响。在本次研究中，上调的差异代谢物中就有可的松。本研究所筛选到的差异代谢物数量较少，后续需要扩大样本量进行差异代谢物的验证。

综上，非靶向代谢组结果显示，儿童肺炎支原体肺炎患者与正常儿童的血清发现19种差异代谢物，主要为磷脂类物质。与对照组相比，病例组有6种代谢物上调，有13种代谢物下调。本研究发现磷脂酰胆碱对肺炎支原体肺炎具有一定的预测价值。

参考文献:

[1]刘金荣,赵成松,赵顺英.《儿童社区获得性肺炎诊疗规范(2019年版)》解读[J].中国实用儿科杂志,2020,35(3):185-187.

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[3]刘宣妤,陈梦琦,李丽博,等.代谢组学在肺系疾病与证候研究中应用现状与展望[J].山东中医杂志,2022,41(10):1142-1147.

[6]谢露,尹晓娟.新生儿肺表面活性物质研究新进展[J].中国儿童保健杂志,2012,20(3):235-237.

[7]魏文峰,褚衍涛,刘烨,等.基于超高效液相色谱-飞行时间质谱技术的肺炎支原体感染小鼠血清代谢组学研究[J].中国中药杂志,2017,42(7):1382-1389.

[8]惠秦,张琪,王琨蒂,等.北京某医院儿童肺炎支原体肺炎患者血清非靶向代谢组学分析[J].中华预防医学杂志,2021,55(5):660-666.

[13]任靖,汪受传,张秋月,等.儿童病毒性肺炎风寒郁肺证代谢组学研究[J].南京中医药大学学报,2017,33(2):193-197.

[14]徐超,迟磊,崔振泽.小儿呼吸道合胞病毒肺炎风热郁肺证脂类及氨基酸类代谢组学研究[J].中国中西医结合儿科学,2022,14(3):197-201.

基金资助:包头医学院科研项目(BYJJ-QM201907);