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人主动脉血管平滑肌细胞铁死亡模型的建立

2024-08-19 109 上传者：管理员

摘要：目的在人主动脉血管平滑肌细胞(HAVSMCs)中建立铁死亡模型并进行验证。方法主动脉平滑肌细胞来源于在华中科技大学同济医学院附属同济医院心脏大血管外科行心脏移植手术的供体主动脉弓组织，分别使用含Imidazole ketone erastin(IKE)和胱氨酸缺失(CD)的培养液对HAVSMCs进行铁死亡诱导，并使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒、人乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒、细胞流式检测及免疫荧光染色来判断平滑肌细胞的铁死亡模型是否建立成功。结果对HAVSMCs进行铁死亡诱导后，光学显微镜下可观察到细胞出现明显形态学改变，流式细胞学分析显示IKE/CD诱导下碘化丙啶(PI)染色阳性细胞所占比例明显升高；CCK-8和LDH检测结果显示，在IKE/CD诱导下HAVSMCs细胞活力明显降低，细胞损伤率明显增加，而铁死亡抑制剂ferrostatin-1则能逆转铁死亡诱导对细胞的毒性作用；BODIPY-C11细胞流式分析及4-羟基壬烯醛(4-HNE)免疫荧光染色显示，IKE/CD诱导的HAVSMCs中脂质过氧化水平明显上升。结论该研究使用IKE以及胱氨酸缺失培养液成功建立了人主动脉血管平滑肌细胞铁死亡模型，为后续研究提供了实验基础。

关键词：
主动脉
细胞死亡
脂质过氧化
血管平滑肌细胞
铁死亡
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对细胞死亡的调控是维持各器官组织正常功能和稳态的重要机制，近年来随着对细胞调控性死亡研究的逐渐深入，发现了越来越多新的细胞死亡方式，如细胞铁死亡、焦亡以及坏死性凋亡等[1-3]。其中铁死亡是一种由细胞内铁过载和脂质过氧化引起的细胞程序性死亡，主要由谷胱甘肽-谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)等抗氧化通路调控[4]。已有研究表明铁死亡与多种心血管疾病的发病密切相关，有望成为新的心血管疾病治疗靶点[5-8]。

主动脉作为人体内最大的动脉，在人的一生中平均运输约2亿升动脉血，而主动脉壁由多种细胞群体及细胞外基质构成，其中人主动脉血管平滑肌细胞(human aortic vascular smooth muscle cells, HAVSMCs)作为主动脉壁的主要细胞成分，在维持主动脉的功能及血流动力学稳定方面起着重要作用[9]。平滑肌细胞功能失调可导致多种严重疾病，例如主动脉瘤及主动脉夹层(aortic aneurysms and dissections, AAD)等，而目前这类疾病的治疗方法主要集中在开胸手术和微创血管覆膜支架置入等，治疗费用昂贵且创伤较大，寻找有效的药物干预靶点对于AAD的防治有着重大临床意义[10-11]。目前已有研究表明HAVSMCs铁死亡调控异常可导致主动脉中层平滑肌细胞丢失，动脉壁发生退行性改变，最终导致AAD的发生[2,12]。因此，靶向HAVSMCs铁死亡有可能为AAD的药物治疗提供新思路，但是平滑肌细胞铁死亡的具体机制目前尚有待进一步探索。本研究成功在人主动脉血管平滑肌细胞中诱导了铁死亡模型并提供了检测细胞铁死亡的多种方法，为进一步探究主动脉相关疾病发病过程中铁死亡这一生物过程的具体作用提供了重要的研究基础。

1、材料与方法

1.1材料和试剂

DMEM/F12培养液购自美国Hyclone公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司，青霉素-链霉素双抗购自美国Thermo Fisher公司，胰酶购自美国Gibco公司，铁死亡诱导剂Imidazole ketone erastin(IKE)购自美国Selleck公司，定制胱氨酸缺失(CD)DMEM高糖培养液购自中国BOSTER公司，铁死亡抑制剂ferrostatin-1(Fer-1)购自美国Selleck公司，Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒购自中国Biosharp公司，人乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒购自日本DOJINDO公司，碘化丙啶(PI)染色试剂盒购自美国Sigma-Aldrich公司，BODIPY-C11试剂盒购自美国Thermo Fisher公司，4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal, 4-HNE)抗体购自美国R&D systems公司。

1.2人主动脉平滑肌细胞培养

本研究中所用的主动脉平滑肌细胞均提取自在华中科技大学同济医学院附属同济医院心脏大血管外科行心脏移植手术的正常供体的主动脉壁组织，且已获得华中科技大学同济医学院附属同济医院伦理委员会审批(No.TJ-IRB20220539)。

将术中修剪下来的主动脉置于4℃预冷的PBS中，撕去主动脉残留的内膜和外膜，将中膜沿肌纤维纹路钝性分离为约1 mm宽的细长薄片，随后将分好的中膜转移至培养瓶内，使用眼科剪将其剪成大小约1 mm3的组织块，将组织块在培养瓶内均匀铺开，然后把培养瓶转移至培养箱内立起放置30 min,使组织块紧贴在培养瓶底，最后缓慢加入含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM/F12培养液(后简称为F12培养液)至没过组织块，将培养瓶平放置于培养箱中。1周后将培养瓶置于显微镜下观察，可见部分组织块周围爬出梭状平滑肌细胞，用胰酶将HAVSMCs消化下来后转移至培养皿内继续用含血清及双抗的F12培养液培养。

1.3 HAVSMCs铁死亡模型诱导

含有5μmol/L浓度IKE的F12培养液或CD培养液用于进行HAVSMCs的铁死亡诱导，2.5μmol/L浓度的Fer-1用于逆转HAVSMCs的铁死亡。

1.4 PI染色细胞流式检测

将HAVSMCs按每孔15万细胞铺入6孔板中，待细胞贴壁后饥饿处理12 h再进行铁死亡诱导，当光镜下观察到细胞出现明显铁死亡改变后，用胰酶将细胞消化下来，置于离心管中1000 r/min离心5 min,弃上清后以每管200μL PBS重悬细胞，转入流式管中，加入PI染液后避光染色15 min,以Beckman Coulter CytoFLEX-3流式细胞仪检测细胞荧光。

1.5细胞活力测定

将HAVSMCs提前使用不含血清的F12培养液进行饥饿培养12 h后，按8000个细胞/孔的密度将HAVSMCs铺入96孔板中，待细胞贴壁后，对照组以普通F12培养液培养，实验组分别给予IKE、CD、IKE+Fer-1及CD+Fer-1处理，随后将CCK-8检测液按1∶10的比例用F12培养液避光配制为工作液，吸弃对照组和实验组各孔中原有培养液后每孔加入100μL CCK-8工作液，继续避光培养2 h后检测各孔450 nm波长处的吸光度值。实验组各组细胞活力以实验组吸光度值与对照组吸光度值的比值表示。

1.6 LDH含量测定

将HAVSMCs进行饥饿培养后铺入96孔板中，实验组及对照组组别设置同上，将细胞进行铁死亡诱导后，在高对照孔加入10μL裂解缓冲液，30 min后每孔加入100μL检测液，避光孵育5 min后每间隔3 min测一次490 nm处吸光度值，待阳性对照孔吸光度值到达2.0左右后每孔加入50μL终止液，再测一次吸光度值。根据各组吸光度值计算细胞损伤比例。

1.7 BODIPY-C11细胞流式检测

将HAVSMCs在6孔板中进行饥饿处理后进行铁死亡诱导，吸弃培养液，将细胞置于含5μmol/L浓度BODIPY-C11探针的培养液中，37℃避光孵育30 min,随后用胰酶将细胞消化下来，离心后弃去上清，用300μL PBS重悬细胞后转入流式管中，以流式细胞仪检测细胞荧光。细胞氧化程度以BODIPY-C11探针氧化后和氧化前的荧光细胞比例表示。

1.8免疫荧光染色

将HAVSMCs以3.5万细胞/孔的密度铺入已经提前放好细胞爬片的24孔板中，饥饿处理后进行铁死亡诱导，随后将细胞以4%的多聚甲醛溶液固定30 min,用PBS清洗3次，以0.2% Triton X-100通透20 min,再次用PBS清洗后以1% BSA溶液封闭1 h, 4-HNE一抗1∶100稀释后4℃孵育过夜。次日将爬片再次以PBS清洗后，避光孵育1∶200稀释的荧光二抗2.5 h,随后DAPI孵育5 min,荧光显微镜拍照。以Image J软件对各处理组进行荧光定量分析。

1.9数据分析

使用GraphPad Prism 8对各组定量数据进行统计学分析，计量资料以均值±标准差表示，两组计量资料均值间比较采用非配对t检验，两组以上计量资料之间均值比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05为差异有统计学意义。

本研究实验流程如图1所示。

图1主动脉平滑肌细胞铁死亡诱导及检测流程图

2、结果

2.1铁死亡诱导下的细胞形态改变以及PI染色细胞流式检测细胞死亡率

对HAVSMCs进行铁死亡诱导一定时间后，光学显微镜下观察可见：对照组HAVSMCs为平整饱满的正常梭型细胞；IKE/CD处理组可见平滑肌细胞明显由梭型转变为圆形，胞体周围透亮度升高，胞质皱缩(图2A)。由于碘化丙啶(PI)不能透过功能和结构完整的细胞膜，只能透过破损的细胞膜与核内的双链DNA结合从而发出红色荧光，因此PI染色流式可以分析死亡细胞所占的比例。在IKE/CD的诱导下可见PI染色阳性的死亡细胞所占比例较对照组明显升高(图2B),从而证实了HAVSMCs中铁死亡的发生。

2.2 CCK-8检测铁死亡诱导下细胞活力变化

CCK-8试剂盒通过检测水溶性四唑盐(WST-8)被线粒体还原所产生的甲臜产物反映细胞活性，被广泛应用于评估细胞增殖活力及细胞毒性损伤等。在该研究中，CCK-8结果显示在IKE/CD诱导下，细胞活力比对照组明显降低，而铁死亡抑制剂Fer-1则能显著逆转铁死亡诱导对细胞的毒性作用(图3),提示IKE及CD处理可成功诱导HAVSMCs发生铁死亡。

图2CD/IKE诱导下的HAVSMCs形态改变以及PI染色流式检测死亡细胞比例

图3CCK-8检测CD/IKE诱导下HAVSMCs细胞活力

2.3 LDH反映细胞损伤比例

在HAVSMCs发生铁死亡的过程中，胞内氧自由基的堆积会导致各细胞器的损伤，进而释放出包括LDH在内的一系列损伤标志物，因此可以通过测定细胞的LDH释放量来验证细胞铁死亡的发生。本研究发现在两种诱导模型中，细胞损伤比例相较对照组均有显著升高，而Fer-1处理的细胞则由于铁死亡抑制剂的保护作用，细胞损伤水平与对照组基本一致(图4)。

图4LDH检测CD/IKE诱导下HAVSMCs细胞损伤率

2.4 BODIPY-C11细胞流式检测氧化细胞比例

BODIPY-C11是一种具有生物活性的脂质氧化荧光探针，在氧化形式和非氧化形式下发射波长分别为510 nm和590 nm,从而反映细胞内脂质过氧化程度，可用于铁死亡的定量。在该研究中，将铁死亡诱导的细胞孵育BODIPY-C11探针后进行流式细胞分析，结果显示IKE/CD诱导使HAVSMCs中被氧化细胞的比例相较对照组大幅度上升(图5)。

图5BODIPY-C11细胞流式检测IKE/CD诱导下HAVSMCs中氧化细胞比例

2.5 4-HNE细胞免疫荧光染色

4-羟基壬烯醛(4-HNE)作为脂质过氧化过程中所产生的醛基产物之一，其在胞内的含量可以一定程度上反映细胞内氧化应激的严重程度，也是判断HAVSMCs是否发生铁死亡的一项重要检测指标。细胞荧光染色显示：IKE/CD处理后HAVSMCs内4-HNE含量显著升高(图6)。

图6IKE/CD诱导后在HAVSMCs中进行4-HNE细胞免疫荧光染色

3、讨论

作为一种新型的细胞调节性死亡方式，铁死亡最早被发现于2012年，以铁依赖的脂质过氧化导致细胞内活性氧ROS的堆积为主要特点，同时伴随着细胞形态、代谢途径及蛋白水平等一系列改变[13]。铁死亡受到多种细胞生命活动的影响，包括细胞内铁稳态、氧化还原相关通路以及细胞自噬等。细胞内铁稳态的维持主要依靠转铁蛋白对铁离子的转运作用以及细胞内铁蛋白对结合铁的储存作用，细胞内铁稳态失衡，细胞内过量的铁离子通过芬顿反应介导活性氧自由基的生成进而导致铁死亡的发生[14]。有研究表明，当铁蛋白ferritin通过选择性自噬途径过度降解时，细胞更容易发生铁死亡[15]。此外，细胞内错综复杂的氧化还原通路对铁死亡的调节也至关重要，其中谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)被认为是抑制铁死亡的主要调节分子，它可以将特定的脂质氧化产物还原为脂质醇，从而抑制细胞铁死亡的发生；线粒体相关凋亡诱导因子2(AIFM2,即FSP1)可以通过催化辅酶Q10的生成进而抑制脂质过氧化物的产生[4,16]。近年来还有越来越多新的铁死亡调控靶点如核因子红系2相关转录因子2(NRF2)-抗氧化反应元件(ARE)通路、二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)等被发现[17-18]。此外铁死亡还被证实与多条炎症通路以及自噬相关通路有着密切联系[19-21]。简而言之，铁死亡的调控机制错综复杂，在这一领域尚有很多谜底等待揭晓。

铁死亡这一概念的出现为多种心血管疾病的治疗和预防提供了新的研究方向，例如有研究[22]发现心肌细胞铁死亡与多柔比星诱导的心肌病进展密切相关；Sampilvanjil等[23]发现香烟提取物可导致大鼠血管平滑肌细胞铁死亡。而本团队在既往研究中发现急性A型主动脉夹层患者的主动脉组织中铁死亡标志物如SLC7A1、FSP1和GPX4等发生了显著改变，而铁死亡抑制剂liproxstatin-1可以显著降低β-氨基丙腈(BAPN)诱导小鼠主动脉夹层的发生率[12],此外我们还发现组蛋白甲基转移酶抑制剂BRD4770可以通过抑制炎症以及HAVSMCs铁死亡从而改善小鼠主动脉扩张，降低BAPN诱导小鼠的夹层发生率和死亡率[2]。这些研究结果说明在主动脉夹层的进展过程中平滑肌细胞的铁死亡发挥了重要作用，对平滑肌细胞铁死亡的机制进行进一步的探究对于防治主动脉夹层及其他相关主动脉疾病有着重大意义。

本研究通过使用药物IKE诱导以及胱氨酸缺失培养液培养的方法，成功在人的主动脉平滑肌细胞中建立了铁死亡模型，并用CCK-8、细胞流式、免疫荧光染色等多种实验方法进行了验证，然而本研究局限于在体外条件下对于平滑肌细胞铁死亡的检测，对于在体条件下铁死亡的研究尚有待进一步实验。总而言之，本研究为后续继续探究主动脉夹层及主动脉瘤等疾病的病理机制、研究临床防治用药提供了新的方向，为进一步揭示铁死亡的分子机制提供了实验基础。

参考文献:

[21]闫学科,宋自芳.microRNAs调控平滑肌细胞表型转化及其在心血管疾病中的作用[J].华中科技大学学报:医学版,2022,51(2):254-261.

基金资助:国家自然科学基金资助项目No.82070488;

文章来源:叶剑楠,魏翔,冯鑫.人主动脉血管平滑肌细胞铁死亡模型的建立[J].华中科技大学学报(医学版),2024,53(04):427-432.