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姜黄素烟酸酯对血管平滑肌细胞增殖、血管再狭窄的影响机制

2025-07-13 46 上传者：管理员

摘要：目的探讨姜黄素烟酸酯(CurTn)对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和血管再狭窄的影响机制。方法将50只SD大鼠随机均分为对照组、模型组、姜黄素组、CurTn组和CurTn+磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂(LY294002)组。采用HE染色和计算机图像分析各组动脉血管组织变化情况；采用免疫组化检测各组动脉血管平滑肌组织阳性细胞磷酸化蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(p-Akt)蛋白表达情况；Westernblotting检测各组动脉血管组织p-Akt蛋白表达情况。结果对照组动脉血管结构正常，分层清晰，内膜完整，管腔无狭窄；模型组血管内膜增厚，VSMC排列紊乱，管腔狭窄。与模型组比较，姜黄素组对血管内膜增厚改善不明显，VSMC排列紊乱；CurTn组及CurTn+LY294002组能抑制内膜增生，改善管壁增厚，VSMC排列稍紊乱，以CurTn+LY294002组效果最佳。免疫组化结果显示，p-Akt蛋白主要表达于动脉血管平滑肌组织细胞胞质中，其阳性表达呈棕黄色。与对照组比较，其他各组I/M值、p-Akt表达水平均升高(P<0.05),CurTn组及CurTn+LY294002组I/M值、p-Akt表达水平低于模型组和姜黄素组(P<0.05),且CurTn+LY294002组低于CurTn组(P<0.05)。结论CurTn通过调控PI3K/Akt信号通路抑制VSMC增殖和内膜增生，从而预防血管再狭窄的发生。

关键词：
PI3K/Akt信号通路
姜黄素烟酸酯
血管内膜增生
血管再狭窄
血管平滑肌细胞
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经皮腔内血管成形术(percutaneoustransluminalangio-plasty,PTA)是治疗动脉狭窄性疾病的主要手段,但术后1年内血管再狭窄的发生率仍然高达40%~60%[1]。血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell,VSMC)的异常增殖是血管再狭窄形成的核心病理机制[2]。研究表明,磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(phosphoinositide3-kinase/serine-threoninekinase,PI3K/Akt)信号通路在调节VSMC增殖和表型转换中起关键作用[3]。尽管姜黄素能够负性调控PI3K/Akt通路[4-5],但其在体内代谢迅速、生物利用度低的特性严重限制了其在临床的应用。新型衍生物姜黄素烟酸酯(curcuminnicotinate,CurTn)是否能够通过调节PI3K/Akt信号通路抑制VSMC的增殖,从而预防PTA术后的血管再狭窄,目前尚无相关研究报道。本研究通过建立大鼠腹主动脉肾下段内膜球囊损伤模型,系统地观察CurTn对血管内膜增生及PI3K/Akt通路关键蛋白表达的影响,旨在为临床防治VSMC增殖和血管再狭窄探索新的治疗策略。

1、材料和方法

1.1材料与试剂

50只雄性SD大鼠(体质量350~400g、10~12周龄)购自广东医科大学动物实验部;姜黄素购自成都德锐可生物科技有限公司;CurTn购自湖南中医药大学药学实验室;2FFogarty球囊导管购自美国BostonScientific公司;免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司;Westernblotting试剂盒和PI3K抑制剂LY294002购自碧云天生物技术研究所;Akt抗体购自英国Abcam公司。

1.2动物处理及分组

将50只SD大鼠随机均分为对照组、模型组、姜黄素组、CurTn组和CurTn+LY294002组,每组10只。对照组仅进行右侧髂动脉分离术,而其他各组则采用2F球囊导管构建腹主动脉肾下段内膜球囊损伤模型[6]。术后,姜黄素组给予300mg/kg的姜黄素溶液灌胃;CurTn组通过尾静脉注射4.8mg/kgCurTn溶液;CurTn+LY294002组在前者基础上加用0.5mg/kg的PI3K抑制剂LY294002溶液(两次给药间隔2h);对照组和模型组则给予等量的生理盐水。各组大鼠均从术前7天开始每日给药,持续至术后第14天处死并取材。实验期间,动物可自由摄食和饮水。

1.3标本处理

术后14天,各组大鼠采用3%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉后,取腹主动脉肾下段血管组织,4%多聚甲醛溶液固定12h,常规梯度乙醇溶液脱水、二甲苯透明、石蜡包埋,石蜡切片成5μm。

1.4HE染色和计算机图像分析

动脉血管组织变化取1.3各组石蜡切片标本经常规脱蜡及复水后行血管HE染色,在光镜下观察各层动脉血管组织结构和血管内膜的增生情况。使用计算机图像分析仪ImageJ软件,分别测量并计算血管内膜(intimal)与中膜(membrane)横断面的面积比(I/M),以内弹力膜作为区分界限,测量过程采用单盲法。

1.5免疫组化检测

动脉血管平滑肌组织阳性细胞p-Akt蛋白表达采用抗大鼠磷酸化Akt(phosphorylatedAkt,pAkt)多克隆抗体(英国Abcam公司)进行检测。石蜡切片经脱蜡水化后,依次进行内源性过氧化物酶封闭、柠檬酸盐缓冲液微波抗原修复及血清封闭。随后切片分别与一抗(4℃孵育过夜)和辣根过氧化物酶标记的二抗(室温孵育1h)结合,PBS洗涤后,DAB显色,苏木精复染细胞核。在Olympus光学显微镜下观察血管内膜和中膜区域中胞核和胞质呈棕黄色的p-Akt阳性细胞。利用计算机图像分析仪ImageJ软件对动脉血管平滑肌组织中的阳性细胞染色进行定量分析[7]。

1.6Westernblotting检测动脉血管组织

p-Akt蛋白表达将血管组织样本加入预冷的RIPA裂解缓冲液中,于冰上进行匀浆处理,离心后取上清液。利用BCA法测定蛋白浓度,并将其调整至2g/L后进行分装。取等量蛋白样品煮沸变性5min,冷却后加入上样缓冲液,于100V恒定电压下,经10%SDSPAGE电泳分离,随后将分离的蛋白转印至PVDF膜上。室温下用5%脱脂奶粉封闭1h,加入一抗pAkt(1∶500)4℃孵育过夜。TBST洗膜3次后,加入HRP标记二抗(1∶5000)室温孵育2h,再次洗膜后采用ECL化学发光法显影,暗室中完成压片、显影及定影,使用AlphaImager2200软件分析条带灰度值。

1.7统计学分析

采用SPSS29.0统计软件分析实验数据。两两比较采用配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组动脉血管组织HE染色结果比较

模型组血管内膜显著增厚,VSMC排列紊乱,管腔狭窄(图1);提示腹主动脉肾下段内膜球囊损伤模型构建成功。对照组动脉血管内膜、中膜及外膜各层次分界清晰,内膜为单层内皮细胞,管壁完整,未见新生内膜形成,管腔未见狭窄。与模型组比较,姜黄素组VSMC结构紊乱,血管内膜增厚改善不明显;CurTn组和CurTn+LY294002组都能有效抑制血管壁内膜增生,VSMC排列稍紊乱,血管壁厚度明显改善;其中CurTn+LY294002组改善程度最明显;提示LY294002能促进CurTn抑制血管内膜增生。

图1各组SD大鼠动脉血管组织HE染色结果比较

2.2各组动脉血管组织I/M值比较

与对照组比较,其他各组I/M值升高(P<0.05)。与模型组或姜黄素组比较,CurTn组和CurTn+LY294002组I/M值降低(P<0.05);与CurTn组比较,CurTn+LY294002组I/M值降低(P<0.05;图2)。

2.3各组动脉血管平滑肌组织阳性细胞p-Akt蛋白表达情况比较

免疫组化结果显示,p-Akt蛋白主要表达于动脉血管平滑肌组织细胞胞质中,其阳性表达呈棕黄色(图3A)。与对照组比较,其他各组p-Akt蛋白表达水平升高(P<0.05);与模型组或姜黄素组比较,CurTn组和CurTn+LY294002组p-Akt蛋白表达水平降低(P<0.05);与CurTn组比较,CurTn+LY294002组蛋白表达水平降低(P<0.05;图3B)。

图2各组动脉血管组织I/M值比较

图3各组SD大鼠动脉血管平滑肌组织阳性细胞p-Akt蛋白表达情况

2.4Westernblotting检测动脉血管组织p-Akt蛋白表达情况

与对照组比较,其他各组p-Akt蛋白表达水平升高(P<0.05);与模型组或姜黄素组比较,CurTn组和CurTn+LY294002组p-Akt蛋白表达水平降低(P<0.05);与CurTn组比较,CurTn+LY294002组蛋白表达水平降低(P<0.05;图4)。

图4Westernblotting检测各组SD大鼠动脉血管组织p-Akt蛋白表达情况

3、讨论

防治PTA术后动脉血管再狭窄一直是医学研究的焦点。PTA术后,动脉血管组织内膜容易受到损伤,这种损伤会激活多种转录因子、生长因子和细胞因子,导致VSMC表型发生改变,进而引起血管内膜的增殖和迁移,以及细胞外基质的产生,这些因素共同作用导致血管重构,最终引发动脉血管再狭窄[3,5]。PI3K/Akt信号通路是一条涉及酪氨酸激酶的级联信号传导路径,其在促进细胞生长、增殖、运动、迁移、侵袭以及促进新生血管生成和抑制细胞凋亡等方面发挥着关键作用[8]。研究表明,PI3K/Akt信号通路能够调节VSMC的增殖,并参与细胞外基质的降解过程,在血管重构中起着重要作用[9]。

姜黄素,一种源自传统中医药的成分,具有抗炎、抗氧化特性以及抑制VSMC异常增殖导致的动脉血管重构的作用,但其疗效欠佳[10]。烟酸又称维生素B3,是人体必需的维生素之一,其不仅能提升高密度脂蛋白水平,还能降低脂蛋白a,是一种显著的调脂药物,但单独使用时不良反应较多[11]。为了克服这两种药物的局限性并发挥其治疗优势,研究人员将烟酸基团结合到姜黄素类化合物中,合成了一种新型的衍生物———CurTn。CurTn不仅具有姜黄素和烟酸的降血脂功效,还具有减少烟酸中游离羧基对胃肠道刺激的作用。通过将姜黄素中的酚羟基酯化,CurTn的稳定性得到了显著提升;同时,引入了水溶性更佳的烟酰基,使得CurTn的水溶性增加,生物利用度提高,从而满足了临床用药的标准。研究显示,CurTn还能分解出单体姜黄素和烟酸,充分发挥姜黄素的抗炎、抗氧化、降血脂等作用,以及烟酸提升高密度脂蛋白水平、改善血管内皮功能、降低总胆固醇和游离脂肪酸等作用[12]。

关于CurTn抑制VSMC增殖的体外和动物实验研究相对较少,其是否能抑制动脉损伤后血管内膜的增生及其作用机制,具有重要的研究价值。本研究构建了实验模型,并在术后第14天对各组动脉血管组织进行了HE染色和I/M值分析。结果显示,与对照组比较,其他组大鼠动脉血管内膜均出现了不同程度新生内膜,内膜厚度不同程度增加,VSMC排列紊乱,血管壁显著增厚,血管管腔不同程度缩小并狭窄。与姜黄素组比较,CurTn组能有效抑制动脉血管内膜的增生,VSMC排列稍显有序,血管壁厚度有显著改善;CurTn与PI3K抑制剂LY294002联合使用时,效果更为显著。进一步研究结果发现,模型建立后各组p-Akt表达水平均显著升高,提示动脉血管内膜损伤后的内膜增生与p-Akt蛋白的异常表达有关;CurTn抑制p-Akt表达的效果明显优于姜黄素,而CurTn与PI3K抑制剂LY294002的联合使用进一步增强了对p-Akt表达的抑制作用,效果最为显著。

综上,在腹主动脉肾下段内膜球囊损伤后,CurTn能够调控PI3K/Akt信号通路的表达,抑制VSMC的增殖和血管内膜的增生,从而预防血管再狭窄的发生。本研究小组的实验数据与其他文献报道存在一定的差异,姜黄素的实验数据疗效不理想且缺乏统计学意义,可能的原因是姜黄素的吸收利用率低和体内代谢消除速度快。至于CurTn是否影响脂代谢、细胞活性因子、VSMC表型转换的相关蛋白以及细胞周期的变化,尚需进一步研究。

参考文献:

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基金资助:深圳市龙华区医疗卫生机构区级科研项目(2020151);

文章来源:彭鹏,鲁才杰,罗衍波.姜黄素烟酸酯对血管平滑肌细胞增殖､血管再狭窄的影响机制[J].中南医学科学杂志,2025,53(04):600-603+612.a