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RNA恒温核酸扩增法在儿童重症肺炎检测中临床意义

2021-04-22 171 上传者：管理员

摘要：目的：探讨RNA恒温核酸扩增法在儿童重症肺炎病原体检测中临床意义。方法：选取我院收治的重症肺炎疾病患儿60例，分别采用PCR荧光探针法和RNA恒温核酸扩增法（SAT）检测患儿肺炎病原体，对比两组检测方式的检测检出率。所有患儿采用相同方式治疗，分析RNA恒温核酸扩增法同儿童重症肺炎严重程度的相关性。结果：RNA恒温核酸扩增法检测出病原体患儿59例，检出率为98.33%,PCR荧光探针法检测出病原体患儿58例，检出率为96.67%，两者差异无统计学意义（P>0.05）；在RNA恒温核酸扩增法转阴时间逐渐延长后，患儿发热持续时间显著延长，淋巴细胞百分比降低，中性粒细胞百分比升高，差异有统计学意义（P<0.05）。RNA恒温核酸扩增法灵敏度为100.00%，特异度为50.00%。结论：在检测儿童重症肺炎病原体时，PCR荧光探针法和RNA恒温核酸扩增法，检出率相当，RNA恒温核酸扩增法对于肺炎发展以及预后可以进行有效评估，灵敏度较高，可以作为一种新型检测儿童重症肺炎病原体方式。

关键词：
RNA恒温核酸扩增法
呼吸道疾病
病原体检测
肺炎
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儿童肺炎是临床中一种常见的呼吸道疾病。近些年，由于环境污染和抗生素耐药等因素导致儿童呼吸疾病频发，其中肺炎也逐年增长[1]。儿童在感染肺炎后需要采用有效的方法进行检测和诊断，从而为下一步治疗提高参考和指导[2]。RNA恒温核酸扩增法是一种新型的检测“活菌”技术，具有无创、简单、直接等特点，可对病原体进行快速正确的检测。目前在临床中针对儿童病原体检测方式中，RNA恒温核酸扩增法已经体现出较高的诊断价值。本研究旨在探讨RNA恒温核酸扩增法在重症肺炎疾病病原体的检测效果，报道如下。

1、对象与方法

1.1研究对象

选取2018年10月-2020年10月我院收治的重症肺炎疾病患儿60例，其中男性35例，女性25例。年龄1～10岁，平均（5.38±1.21）岁。分别采用PCR荧光探针法和RNA恒温核酸扩增法（SAT）检测患儿肺炎病原体。

入组标准：(1)所有患儿均为重症肺炎疾病，同意分别采用两种检测方式；(2)除肺炎疾病外，所有患儿其它功能正常；(3)所有患儿及患儿家属均已知情同意本研究，并签订书面知情书。排除标准：(1)中途因故退出研究组；(2)患有传染病和先天性营养不良。

1.2仪器与试剂

主要采用定量PCR仪（美国AppliedBiosystemsABI7500型，上海巴玖实业有限公司）展开检测，可对患者展开五色荧光检测操作，表现出操作全面以及广泛特点。具体体现为病原体绝对定量分析、基因表达分析、阳性内对照以及SNP基因型分析等。通过五色荧光滤光片，分辨诸多荧光染料。

1.3方法

1.3.1RNA恒温核酸扩增法分析

首先针对患儿标本进行采集，以冻存方式保存，待检测时取出恢复至室温后加500μl裂解液，150μl核酸提取液，同时设置对照[3]。在室内恒温55℃静置5min后，放入磁珠分离装置上，针对管盖上流质性液体以及泡沫有效吸净，并且做到干净清洗，完成后准备核酸扩增液50μl倒入。摇匀后，于另一支微量反应管仲，将磁珠悬液25μl倒入，保持60℃室内温度，对于恒温保持做出保证，保持5min停留后，合理进行核酸扩增酶20μl采取，再次置入所得标本，对于检测利用RNA恒温核酸扩增法完成。对于反应程序而言，主要通过FAM荧光通道，在1min、42℃条件下完成40循环创建，分析溶解曲线。设置阈值，读取DT值。阳性：DT值≤35；阴性：DT值≥40。对DT值35～40的样品重新扩增，阳性：最终结果≤35，阴性：最终结果>35。

1.3.2PCR荧光探针法分析

首先针对患儿标本进行采集，以冻存标本方式保存，取出标本，并将其恢复室温，利用机械将标本进行离心，转速为1200r/min，时间为5min，将上清液去除，对沉淀物质进行保留。准备脱氧核糖核酸提取液40μl于其中置入。合理展开干浴处理操作，环境为100℃。控制20min处理时间。之后针对标本展开离心操作，时间为1200r/min，将上清液去除，对沉淀物质进行选取，并且于沉淀物质反应管中，将反应溶液50μl、洗涤溶液4μl以及扩增酶4μl加入，合理展开扩增处理操作。对于反应程序：主要利用FAM荧光通道完成，2min,93℃，1个循环；45s,93℃，60s,55℃，10个循环；30s,93℃，45s,55℃，30个循环；设置阈值，读取CT植，阴性：最终CT值<30。

1.4观察指标

比较两组检查方式检出率；分析RNA恒温核酸扩增法同儿童重症肺炎严重程度的相关性，比较发热天数、淋巴细胞、中性粒细胞。

1.5统计学方法

应用SPSS22.0统计软件分析数据。计量资料用表示，采用t检验；计数资料用（%）表示，采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1两组检测方式检出率比较

RNA恒温核酸扩增法检测出病原体患儿59例，检出率为98.33%,PCR荧光探针法检测出病原体患儿58例，检出率为96.67%，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1两组检测方式肺炎病原体检出率比较[例（%）]

2.2RNA恒温核酸扩增法同儿童重症肺炎严重程度的相关性

随着RNA恒温核酸扩增法转阴时间延长，患儿发热持续时间显著延长，淋巴细胞百分比降低，中性粒细胞百分比升高，差异有统计学意义（r=38.297,14.539,11.470,P均<0.05）。

2.3两种检测方法灵敏度以及特异度比较

将PCR荧光探针法检出阳性率以及阴性率作为对照，依据公式对RNA恒温核酸扩增法相对灵敏度以及特异度进行计算，得出RNA恒温核酸扩增法灵敏度为100.00%，特异度为50.00%，见表2。

表2两种检测方法灵敏度以及特异度比较（例）

3、讨论

对于儿童肺炎疾病而言，临床表现出较高发病率，尤其以学龄前儿童群体多见。在我国，肺炎住院患儿呈现出显著增加趋势。此类患儿在病症发作后，呈现出多样化症状，且发病反复，表现出较长治疗周期，且治疗期间存在较高概率导致患者表现出一系列并发症[4,5]。但于发病初期，未有明显症状，往往同病毒性感冒以及感冒咳嗽相混淆，极易发生误诊，从而延误了治疗时间。因此，确定有效检测方法存在显著意义，并尽快接受治疗，以免肺炎波及患儿脑部、心脏等多个器官，造成凝血功能紊乱和中枢神经系统症状，甚至死亡。

本研究对60例重症肺炎疾病患儿进行分析对比，RNA恒温核酸扩增法检测出59例病原体患儿，检出率为98.33%,PCR荧光探针法检测出58例病原体患儿，检出率为96.67%，差异无统计学意义（P>0.05）；在RNA恒温核酸扩增法转阴时间逐渐延长后，患儿发热持续时间显著延长，淋巴细胞百分比降低，中性粒细胞百分比升高，差异有统计学意义（P<0.05）。RNA恒温核酸扩增法灵敏度为100.00%，特异度为50.00%。说明采用RNA恒温核酸扩增法检测法有较高的临床使用价值，与武能舜[6]研究相一致，进一步说明RNA恒温核酸扩增法的可靠性。

综上所述，在检测儿童重症肺炎病原体时，PCR荧光探针法和RNA恒温核酸扩增法，检出率相当，RNA恒温核酸扩增法对于肺炎发展以及预后可以进行有效评估，灵敏度较高，可以作为一种新型检测儿童重症肺炎病原体方式。

参考文献：

[1]周杰,张莉,张鲍虎,等.RNA恒温扩增法在肺炎支原体检测中的应用[J].海南医学,2019,28(9):1433-1435.

[2]官雁鸣,许洪琴,俞颖.核糖核酸恒温扩增技术在儿童肺炎支原体感染诊断中的应用[J].浙江临床医学,2019,(10):1383-1384.

[3]武能舜,彭晨娜,张彬伟.RNA恒温扩增法在肺炎支原体检测中的应用效果[J].当代医学,2020,26(30):44-46.

[4]郑萍,张建昭,董静静,等.基于RNA恒温扩增技术诊断的儿童肺炎支原体脑炎临床特征分析[J].中国医刊,2020,55(1):72-76.

[5]葛梦蕾,殷芳,赵汉青,等.肺炎支原体抗体滴度和RNA检测在儿童肺炎支原体肺炎诊疗中的应用价值[J].中华检验医学杂志,2020,43(11):1106-1111.

[6]武能舜.RNA恒温扩增检测技术用于诊断儿童肺炎支原体肺炎[J].牡丹江医学院学报,2020,41(2):123-125,156.

张娟娟.RNA恒温核酸扩增法在儿童重症肺炎病原体检测中临床意义[J].中国误诊学杂志,2021,16(04):303-305.