2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）患者心血管发病率高，尤其下肢动脉并发症，是患者致残的主要原因[1,2,3]，而内皮功能障碍是其主要始发原因[4,5]。股动脉是供应下肢骨骼肌的主要血管之一，其内皮功能障碍可致患者下肢血管病变，供血不足。在控制血糖基础上，及时预防和改善股动脉内皮功能，对降低糖尿病患者下肢动脉并发症的发生率至关重要。作为非药物治疗的重要手段之一，规律运动已经被越来越多糖尿病患者所接受[6]。基础和临床研究表明，规律有氧运动可改善T2DM患者主动脉内皮功能障碍[7,8,9,10]。本课题利用链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）制备T2DM大鼠模型，探讨有氧运动是否改善股动脉内皮功能障碍；如果可以，进一步研究其机制。

1、材料与方法

1.1实验动物与材料

8周雄性健康SPF级SD大鼠（204±7.3g），购自上海必凯实验动物有限公司[许可证编号：SCXK（沪）2018—0006]，自由饮食饮水。高糖高脂饲料按文献配比如下[11]:66.5%基础饲料，20.0%蔗糖，10.0%熟猪油，2.5%胆固醇，1.0%胆酸盐。一氧化氮（nitric oxide,NO）试剂盒购自碧云天生物技术研究所，e NOS抗体购自美国abcam公司，p-e NOS抗体购自爱必信生物科技有限公司，Akt和p-Akt抗体购自博士德生物工程有限公司，PI3K抗体购自美国CST公司，STZ购自美国Sigma公司。DMT血管环张力记录仪购自丹麦Danish Myo Technology A/S公司。

1.2分组

40只SD大鼠，随机选取其中14只大鼠分别设为对照组（Con,n=7）和对照运动组（Con-Ex,n=7），喂普通饲料。高糖高脂饲料饲养剩余26大鼠1个月，一次性腹腔注射STZ(30mg/kg，溶于p H=4.2,0.1mol/L枸橼酸缓冲液），继续高糖高脂饲养。Con和Con-Ex组腹腔注射等量枸橼酸缓冲液。3天后大鼠尾静脉采血测空腹血糖，≥16.7mmol/L表示T2DM大鼠造模成功。本次实验造模成功16只，持续高糖高脂喂养，并随机分为：T2DM组（n=8）和T2DM运动组（T2DM-Ex,n=8）。Con和T2DM大鼠不进行运动训练，Con-Ex和T2DM-Ex进行12周有氧运动。

1.3运动方案

根据文献，采用改进版Ploug游泳训练方案[12]，游泳池水深50cm，水温（30±1）℃。第1天游泳10min，第2天游泳20min，以后每天递增10min，直至第6天游泳时间递增至60min。从第2周开始，每周运动6天，每天游泳60min，持续12周。游泳期间课题组人员在旁边观察大鼠状态，防止大鼠溺亡。

1.4取材

运动开始前和12周游泳结束后，各组大鼠禁食6h，尾动脉采血测空腹血糖、口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test,OGTT）和血浆胰岛素。然后，3%戊巴比妥钠（50mg/kg,ip）麻醉大鼠，EDTA抗凝腹主动脉采血，3000g/min,4℃离心10min，取上清-80℃保存。分离两侧股动脉后，部分用于离体血管实验；一部分制作组织匀浆；一部分液氮保存用于Western Blot检测。

1.5空腹血糖、血浆胰岛素测定和胰岛素敏感指数计算

血糖仪测血糖，ELISA测定血浆胰岛素。根据公式计算。计算稳态模型评估胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR）=空腹血糖（fasting blood glucose,FBG）×空腹胰岛素（fasting insulin,FINS））/22.5。

1.6 OGTT

各组大鼠灌胃50%葡萄糖（2g/kg），并分别在0、15、30、60、120min尾静脉采血，血糖仪测定各时间点血糖值，绘制OGTT曲线并通过Prism软件计算曲线下面积（area under curve,AUCOGTT）。

1.7血浆和股动脉NO

血浆和股动脉NO按试剂盒说明操作。

1.8离体血管实验

迅速置股动脉于4℃，且持续通以95%O2+5%CO2混合气体PSS液（成分如下，mmol/L:KCl 5.8,Na Cl 144,Ca Cl22.5,Mg Cl21.2，葡萄糖11,Hepes5,p H 7.4）。显微镜下分离股动脉周围脂肪和结缔组织，将内径150—400μm股动脉剪成2 mm动脉环，用直径40µm钨丝将其固定于DMT血管环张力记录仪浴槽内。浴槽内含37℃PSS液，并持续通入95%O2+5%CO2混合气体。股动脉平衡30min后，标准化其内周长尺寸至100mm Hg跨壁压时所有。为保障血管活性，实验初始，用80mmol/L KCl收缩动脉确保其功能完整。在浴管中以累积给药方法加入10-8—10-4mol/L去氧肾上腺素（Phenylephrine,PE），获取PE累积浓度-反应曲线，以反应血管的收缩功能。PSS液冲洗使股动脉张力回归静息状态1h后，用10-5mol/L PE收缩血管至稳定平台，然后分别加入乙酰胆碱（Acetylcholine,ACh,10-10—10-5mol/L）和硝普钠（Sodium nitroprusside,SNP,10-10—10-4mol/L），以10-5mol/L PE诱导收缩为100%，计算ACh和SNP舒张百分比，以分别反映血管内皮依赖性和非内皮依赖性舒张功能。

1.9 Western Blot

加入液氮快速研磨股动脉至匀浆，然后用含有磷酸酶抑制剂及蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液冰上裂解后，13000g/min,4℃离心20min。BCA试剂盒测定上清液蛋白浓度，并根据蛋白浓度调整上样，聚丙烯酰胺凝胶4℃90V电泳30min,120V电泳1.5h，转膜后5%BSA封闭2h，加入特异性一抗：p-e NOS(abs138458,1∶1000),e NOS(ab5589,1∶1000),Akt(A00024,1∶500),p-Akt(P00024-6,1∶500),PI3K(CST4249,1∶1000)4℃过夜。室温下加入相应二抗（山羊抗兔Ig G；山羊抗小鼠Ig G）孵育1h,TBST洗涤，ECL发光液显色，凝胶成像系统扫描成像，Image Lab软件进行灰度值分析。以内参β-actin标准化各条带灰度值。

1.1 0统计学分析

数据以均数±标准差表示，采用Graph Pad Prism作图，SPSS 14.0统计学分析。组间数据比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD。P<0.05为差异具有显著性。

2、结果

2.1有氧运动对T2DM大鼠空腹血糖、胰岛素、HOMA-IR的影响

如表1所示，开始运动前，4组大鼠血糖（F=4.38,P=0.021）、胰岛素（F=3.98,P=0.037）、HOMA-IR(F=3.34,P=0.040）之间有显著性差异。T2DM大鼠空腹血糖高于Con组（P=0.014），且血浆胰岛素水平较低（P=0.031),HOMA-IR较高（P=0.026），造模成功。12周实验结束时，4组大鼠血糖（F=4.53,P=0.016）、胰岛素（F=3.40,P=0.041）、HOMA-IR(F=4.11,P=0.026）之间有差异。T2DM大鼠空腹血糖、胰岛素水平和HOMA-IR均较Con组大鼠高（P值分别为0.012,0.032,0.005）。12周游泳训练显著降低T2DM大鼠血糖、胰岛素及HOMA-IR(P值分别为0.040,0.047,0.033）。

2.2有氧运动对T2DM大鼠OGTT的影响

如图1所示，运动开始前、后，4组大鼠AU-COGTT（运动前F=4.90,P=0.012；运动后F=4.15,P=0.023）之间均有显著性差异。T2DM大鼠AU-COGTT较Con组高（P=0.011），表明此时已经出现糖耐量异常，并且一直持续至实验结束（P=0.006）。而12周游泳虽然对Con组大鼠AUCOGTT无显著影响，但显著降低T2DM大鼠AUCOGTT(P=0.018）。提示有氧运动改善T2DM大鼠口服糖耐量。

表1 12周有氧运动对T2DM大鼠空腹血糖和血浆胰岛素水平影响

图1 12周游泳对T2DM大鼠口服糖耐量实验（OGTT）的影响

2.3有氧运动对T2DM大鼠血浆和股动脉NO含量的影响

如表2所示，4组大鼠血浆（F=3.30,P=0.046）和股动脉（F=3.91,P=0.039)NO含量之间有显著性差异。与Con大鼠比较，T2DM大鼠血浆（P=0.034）和股动脉（P=0.031)NO含量均下降。与Con组比较，12周规律游泳训练同时增加Con组和T2DM-Ex组大鼠血浆（P值分别为0.041和0.046）和股动脉（P值分别为0.024和0.022)NO含量。

2.4有氧运动对T2DM大鼠离体股动脉血管反应性的影响

4组大鼠对PE(F=3.41,P=0.042）、ACh(F=7.21,P=0.003）介导的反应有显著性差异，但对SNP介导的舒张反应无显著性差异（F=0.25,P=0.861）。相较于Con组大鼠，12周有氧运动增加Con大鼠离体股动脉对ACh内皮依赖性舒张（P=0.035），但是对PE介导的收缩和非内皮依赖性舒血管反应则无明显影响；而T2DM大鼠离体股动脉对PE的缩血管反应较Con组增加（P=0.037），内皮依赖的舒张反应ACh显著减弱（P=0.001），非内皮依赖性舒张SNP的舒张无显著改变，此结果提示T2DM大鼠股动脉内皮功能障碍。与T2DM组比较，12周持续有氧运动显著改善T2DM大鼠股动脉上述改变：降低PE缩血管效应（P=0.026），增加ACh舒血管反应（P=0.002）。

表2 12周有氧运动对T2DM大鼠血浆和股动脉NO水平影响

2.5有氧运动对T2DM大鼠动脉PI3K/Akt/e NOS的影响

上述结果提示，规律有氧运动可改善T2DM大鼠股动脉内皮功能障碍。我们进一步探讨其可能机制。Western Blot结果显示，4组大鼠股动脉PI3K(F=3.10,P=0.050）、p-e NOS(F=57.82,P=0.001）、pAkt(F=33.36,P=0.002）蛋白表达有显著性差异，但是e NOS(F=1.58,P=0.268）和Akt(F=1.67,P=0.249）蛋白表达无差异。两两比较发现，规律有氧运动对Con大鼠和T2DM大鼠股动脉Akt及e NOS蛋白表达无显著影响，但却增加PI3K(Con-Ex组vs Con组P=0.027,T2DM-Ex组vs T2DM组P=0.043）、p-Akt(Con-Ex组vs Con组P=0.035,T2DM-Ex组vs T2DM组P=0.032）、p-e NOS(Con-Ex组vs Con组P=0.005,T2DM-Ex组vs T2DM组P=0.001）蛋白表达，进而增加p-Akt/Akt(Con-Ex组vs Con组P=0.044,T2DM-Ex组vs T2DM组P=0.037）、p-e NOS/e NOS(Con-Ex组vs Con组P=0.028,T2DM-Ex组vs T2DM组P=0.012）蛋白表达（图3，表3）。

图2 12周游泳对T2DM大鼠离体股动脉对PE(10-8—10-4 mol/L）、ACh(10-10—10-5 mol/L）和SNP(10-9—10-4 mol/L）血管反应性的影响

表3 12周有氧运动对T2DM大鼠股动脉PI3K/Akt/e NOS通路相关蛋白相对表达量的影响

3、讨论

糖尿病是严重威胁我国人民健康的慢性代谢性疾病。血管内皮功能障碍在患者糖耐量异常早期阶段就已经存在，并参与动脉粥样硬化等血管并发症的发生发展。强度适宜、节奏感强、安全性高是规律有氧运动的主要特点。结合血糖的有效控制，规律运动已成为逆转2型糖尿病患者血管功能障碍，预防心血管疾病的有效策略。本研究结果提示，规律有氧运动（12周游泳训练）可通过激活T2DM大鼠股动脉PI3K/Akt/e NOS/NO途径改善股动脉内皮功能障碍。

研究报道，雄性大鼠较雌性大鼠对STZ敏感性更敏感[13]。因此，本项目采用高脂高糖饲养雄性SD大鼠4周后，腹腔注射STZ 30mg/kg制备T2DM大鼠模型。结果显示，T2DM大鼠空腹血糖升高，糖耐量降低，出现胰岛素抵抗，提示2型糖尿病大鼠造模成功。已知运动类型、持续时间和强度等因素都可能影响血管功能的改善[14]：有氧运动单独或联合阻抗运动改善2型糖尿病患者大血管内皮功能[15,16]；在相同的热量消耗情况下，中等强度持续训练对血管内皮功能和血糖改善作用明显[17]。通过较多消耗能量，增加外周组织对葡萄糖的利用，规律有氧运动有助于改善2型糖尿病患者糖代谢，糖耐量和胰岛素抵抗性。因此，本研究方案确定为12周持续中等有氧运动（每日游泳60 min）。

图3 12周有氧运动对T2DM大鼠股动脉PI3K/Akt/e NOS通路相关蛋白表达的影响

血管内皮功能障碍是2型糖尿病患者血管并发症（大血管和微动脉）始动因素和早期最显著的改变。此时，患者内皮细胞舒血管物质分泌减少，如NO，而缩血管物质分泌增加；同时对血管活性物质的反应性出现改变，主要体现为内皮依赖性舒血管反应（ACh）降低，而对缩血管物质，如α受体激动剂PE反应增加。C57BL/6J肥胖大鼠和胰岛素抵抗小鼠股动脉对ACh舒张反应降低[18,19]。本项目也发现T2DM大鼠血浆和股动脉NO水平降低；股动脉对缩血管物质反应性增加，而内皮依赖性舒张反应降低。这些都提示2型糖尿病动物股动脉存在内皮功能障碍，需要及早干预，避免发生进一步恶化。本课题组研究结果显示，12周规律游泳增加Con大鼠和T2DM大鼠血浆和股动脉NO水平，同时也增加T2DM大鼠股动脉对ACh内皮依赖性舒张，降低其对PE的缩血管反应。研究认为，通过增加心率、循环血量，产生稳定而较高速的血流，中等强度有氧运动可增加大血管壁剪切应力，进而激活和维持内源性NO释放，改善动脉舒张功能[20,21,22,23,24,25]。马丽琼等[15]也发现，6个月规律有氧运动锻炼（游泳、慢跑、快步走、太极拳等）在有效控制2型糖尿病患者血糖同时，显著改善肱动脉内皮依赖性舒张。可见规律持续有氧运动有利于降低股动脉阻力，增加其血液流速，进而增加骨骼肌血液供应。以上这些研究，都为今后临床2型糖尿病患者的运动治疗方案提供了有力的基础理论支持。

磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶/NO(PI3K/Akt/e NOS/NO）途径是调节血管张力和内皮功能的主要通路。血管NO主要受e NOS调控，e NOS/NO是血管内皮重要的保护机制。而e NOS主要受上游PI3K/Akt信号途径调控。PI3K磷酸化下游Akt丝氨酸473(Ser 473），形成磷酸化Akt(p-Akt）。进一步，p-Akt促使e NOS ser1177位点磷酸化，激活e NOS，促进NO生成[26,27]。研究证实，高糖和胰岛素抵抗均可抑制血管内皮PI3K/Akt/e NOS/NO途径，导致内皮功能障碍，进而促进糖尿病患者血管病变[28,29,30,31,32]。我们的研究结果也显示T2DM大鼠股动脉PI3K/Akt/e NOS/NO通路关键蛋白的激活形式（p-Akt,p-e NOS）表达下降。目前，PI3K/Akt/e NOS/NO途径已经成为药物和运动改善糖尿病患者血管内皮功能障碍的重要靶点之一[33]。研究显示，8周有氧运动联合阻抗运动通过PI3K/Akt/e NOS/NO途径改善主动脉内皮功能障碍[11]。且有氧运动增加高血压大鼠肠系膜动脉e NOS表达[34,35]。因此，我们合理推测，规律有氧运动可能通过影响股动脉PI3K/Akt/e NOS/NO通路而改善T2DM大鼠股动脉内皮功能障碍。我们进一步利用Western blot检查此通路相关蛋白表达的改变。结果显示，虽然有氧运动并没有显著改变T2DM大鼠股动脉Akt,e NOS蛋白表达，但却明显上调T2DM大鼠PI3K,p-Akt,p-e NOS蛋白表达，进而增加p-Akt/Akt,p-e NOS/e NOS。上述结果提示，规律有氧运动改善T2DM大鼠股动脉内皮功能障碍与PI3K/Akt/e NOS/NO通路有关。但需要注意的是，规律有氧运动改善股动脉内皮功能障碍的机制还很复杂，是否有其他机制，如降低血管炎症，缓解氧化应激等参与尚未可知。后续课题组将会进一步深入研究。

4、结论

规律有氧运动可激活T2DM大鼠股动脉PI3K/Akt/e NOS/NO通路，进而改善其内皮功能障碍，预防下肢动脉血管病变。

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文章来源：张翠玲,宋奇颖,任建荣,荆达.有氧运动改善2型糖尿病大鼠股动脉内皮功能障碍的作用及机制[J].中国康复医学杂志,2022,37(02):155-161+175.