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超高效液相色谱法测定血浆中倍硫磷及其主要代谢产物

2024-10-28 72 上传者：管理员

摘要：目的建立血浆中倍硫磷及其5种代谢物（倍硫磷氧化物、倍硫磷砜、倍硫磷亚砜、倍硫磷氧砜和倍硫磷氧亚砜）的超高效液相色谱（UPLC）测定方法。方法取0.50 mL待测血浆经乙酸乙酯+乙腈混合溶液（体积比1∶1）萃取，氮气吹干，甲醇定容，采用ACQUITY UPLC BEH C18柱分离，以甲醇和甲酸水溶液为流动相梯度洗脱，二极管阵列检测器检测，以保留时间和吸收光谱定性，以峰面积外标法定量。结果倍硫磷及其5种代谢物在各自线性范围内相关性良好，相关系数为0.999 8～0.999 9；检出限0.1～0.2 mg/L，定量限0.3～0.6 mg/L，加标回收率为87.18%～111.02%。批内精密度为0.52%～9.86%，批间精密度为1.07%～7.19%。除倍硫磷氧砜外，样品可在-40℃保存7 d。结论本方法准确可靠，简便实用，可用于测定血浆中倍硫磷及其5种代谢物。

关键词：
代谢产物
倍硫磷
有机磷农药
血浆
超高效液相色谱法
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倍硫磷（fenthion）是一种典型的有机磷农药，常见的商品剂型主要有颗粒剂和乳油。我国自2007年1月1日起全面禁止使用甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷、久效磷和磷胺5种高毒有机磷农药后，倍硫磷等低毒类农药使用更为广泛[1]，造成的中毒病例也日益增多[2-3]。倍硫磷在哺乳动物体内的代谢过程和主要代谢产物比较清楚，倍硫磷原型主要在细胞色素氧化酶系和黄素单氧化酶的催化作用下生成倍硫磷氧化物、倍硫磷砜、倍硫磷亚砜、倍硫磷氧砜和倍硫磷氧亚砜5种代谢产物，氧化代谢产物的毒性高于倍硫磷原型[4]。目前，针对水[5]、牛奶[6]、蔬菜[7]、水果[8]等环境样品中倍硫磷及其代谢产物的检测方法虽已有报道[9-11]，但尚未见血浆中倍硫磷及其代谢产物的检测方法。本研究拟建立血浆中倍硫磷及其代谢产物的超高效液相色谱检测方法，并对建立的方法进行评价。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器

ACQUITY超高效液相色谱（UPLC）仪（美国Waters公司）；DC-12氮吹仪（上海安谱科学仪器有限公司）；Simplicity UV超纯水系统（法国Millipore公司）；AUW220D 1/10万电子天平（日本岛津公司）；MS3漩涡混匀器（德国IKA公司）；小型高速离心机（Microfuge 16，德国Beckman公司）。

1.1.2试剂耗材

亲水聚四氟乙烯针式滤器（PTFE,13 mm,0.22μm）、疏水聚四氟乙烯针式滤器（PTFE,13 mm,0.22μm）、有机相针式滤器（尼龙）（13 mm,0.22μm）均购自上海安谱实验科技股份有限公司；固相支撑液液萃取柱（ISOLUTE SLE+，瑞典Biotage公司）；ACQUITY UPLC BEH C18柱（50.00 mm×2.10 mm×1.70μm，美国Waters公司）。乙酸乙酯、乙腈、甲苯、异丙醇、甲醇、甲酸（均为色谱纯），以及倍硫磷（质量分数95.5%）、倍硫磷氧化物（质量分数99.9%）、倍硫磷亚砜（质量分数98.2%）、倍硫磷氧化亚砜（质量分数99.9%）均购自上海安谱璀世标准技术服务有限公司；倍硫磷砜（质量分数99.0%）购自天津阿尔塔科技有限公司，倍硫磷氧砜（质量分数98.8%）购自坛墨质检标准物质中心，倍硫磷乳油（质量分数50%）购自浙江吉顺植物科技有限公司；马血浆购自平睿生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1色谱条件

以ACQUITY UPLC BEH C18柱分离，流动相A为甲醇，流动相B为质量分数0.1%的甲酸水溶液，二元梯度洗脱分离，梯度洗脱程序，见表1。柱温为40℃，样品室温度为4℃，流动相流速为0.3 mL/min，进样体积为2μL。以光电二极管列阵检测器（photo-diode array,PDA）检测。

1.2.2标准溶液的配制

表1二元梯度洗脱程序

分别称取倍硫磷及其代谢产物各50.00 mg，置于5.00 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容，配制成质量浓度为10.00 mg/mL的标准储备液，避光保存。

1.2.3标准系列配制和测定

分别取质量浓度为10.00 mg/mL倍硫磷及其5种代谢产物的混合标准储备液，用甲醇稀释成质量浓度分别为10.00、20.00、30.00、40.00和50.00 mg/L的混合标准系列，将UPLC仪调至最佳状态后，按照1.2.1节的色谱条件进行测定。以保留时间和吸收光谱定性，以峰面积定量，计算回归方程。

1.2.4样品前处理

取0.50 mL血浆于2.00 mL离心管中，加入1.00 mL乙酸乙酯+乙腈混合溶液（体积比1:1），漩涡振荡5.00 min,4℃、14 800 r/min离心3.00 min（离心半径15 cm），取上层有机相，下层再次加入1.00 mL乙酸乙酯+乙腈混合溶液重复萃取1次，合并有机相，25℃氮气吹至近干，残留物以0.50 mL甲醇溶解，漩涡振荡60 s,0.22μm亲水PTFE过滤器过滤后待测。

2、结果

2.1色谱条件的选择

根据1.2.1节条件进样，倍硫磷及其5种代谢物（Ⅰ：倍硫磷氧亚砜、Ⅱ：倍硫磷氧砜、Ⅲ：倍硫磷亚砜、Ⅳ：倍硫磷砜、Ⅴ：倍硫磷氧化物、Ⅵ：倍硫磷；下文Ⅰ～Ⅵ指代与此相同）在6.00 min内得到良好分离，标准品、空白血浆和加标血浆色谱图见图1、2和3。

图1 50.00 mg/L倍硫磷及其5种代谢产物标准品色谱图

图2空白血浆色谱图

图3血浆中50.00 mg/L倍硫磷及其5种代谢产物色谱图

2.2萃取剂的选择

取0.50 mL空白血浆于2.00 mL离心管中，加入混合标准溶液，配制成质量浓度均为50.00 mg/L的倍硫磷及其5种代谢产物的加标血浆。（1）传统液液萃取：取0.50 mL加标血浆分别使用乙酸乙酯、乙腈、乙酸乙酯+乙腈混合溶液（体积比1∶1）和甲苯+异丙醇混合溶液（体积比1∶1）为萃取液，按照1.2.4节方法萃取，重复6次。（2）固相支撑的液液萃取，取0.50 mL加标血浆置于固相支撑柱中，5 min后加入1.5 mL乙酸乙酯淋洗2次，收集洗脱液，25℃氮气吹至近干，残留物以0.50 mL甲醇溶解，漩涡振荡60 s,0.22μm无机相滤膜过滤后待测。结果显示，固相支撑的液液萃取和乙酸乙酯+乙腈混合溶液对倍硫磷的5种代谢产物回收率均较高，但固相支撑的液液萃取对倍硫磷原型的回收率欠佳，其他液液萃取溶剂的回收率均低于乙酸乙酯+乙腈混合溶液。综合考虑加标回收率、有机溶剂的毒性、经济性和方便程度，选择乙酸乙酯+乙腈（体积比1∶1）液液萃取作为样品前处理的方法。见表2。

2.3滤器的选择

取质量浓度为10.00 mg/mL的混合标准储备液，用甲醇稀释成质量浓度分别为2.00、10.00和50.00 mg/L的混合标准溶液，分别过亲水聚四氟乙烯针式滤器、疏水聚四氟乙烯针式滤器和有机相针式滤器（尼龙），按照1.2.1节的色谱条件检测。不同滤器过滤倍硫磷及其5种代谢产物的回收率见表3，有机相针式滤器（尼龙）对部分成分有增强作用，亲水聚四氟乙烯针式滤器、疏水聚四氟乙烯针式滤器对倍硫磷及其5种代谢产物的回收率无明显影响。

表2不同样品前处理方法对倍硫磷及其5种代谢产物加标回收率的影响

表3不同滤器对倍硫磷及其5种代谢产物回收率的影响

2.4进样量的选择

取质量浓度为50.00 mg/mL、20 mg/mL和10 mg/mL的混合标准溶液，分别以2μL、5μL和10μL进样，进样目标化合物均为0.1 mg。按照1.2.1节的色谱条件检测。结果发现随着进样量的增加，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ峰型变差，见图4，故选择2μL进样量进行检测。

图4不同进样量倍硫磷及其5种代谢产物色谱图

2.5吸收波长的选择

以二极管阵列检测器200～400 nm对各出峰组分进行扫描，选择各组分最大吸收波长作为检测波长，为避免检测波长的影响，在摸索前处理及色谱分析条件时均以251 nm作为检测波长。物质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的最大吸附波长分别为237.7 nm、225.9 nm、240.1 nm、230.6 nm、250.7 nm和251.9 nm。各组分紫外吸收光谱见图5。

2.6线性范围和检出限

在本方法检测条件下，倍硫磷氧亚砜、倍硫磷氧砜、倍硫磷亚砜、倍硫磷砜、倍硫磷氧化物和倍硫磷分别在0.60～50.00 mg/L、0.30～50.00 mg/L、0.60～50.00 mg/L、0.30～50.00 mg/L、0.30～50.00 mg/L和0.30～50.00 mg/L范围内线性关系良好，相关系数为0.999 8～0.999 9，以3倍信噪比确定的检出限分别为0.1～0.2 mg/L，以10倍信噪比确定的定量限为0.3～0.6 mg/L。标准曲线、相关系数、检出限和定量限见表4。

2.7准确度和精密度实验

分别取0.50 mL空白血浆，加入一定量的倍硫磷及其5种代谢产物混合标准溶液，配制成倍硫磷及其5种代谢产物质量浓度均为2.00、10.00和50.00 mg/L的加标血浆，每组6个样品，按照1.2.1和1.2.2的方法测定倍硫磷及其5种代谢产物，计算加标回收率为87.18%～111.02%，批内精密度为0.52%～9.86%。参照批内精密度实验的方法配制加标血浆，在7 d内测定6次，每次6个样品，代入当日制作的回归方程计算倍硫磷及其5种代谢产物，计算批间加标回收率为71.50%～107.50%，批间精密度（RSD）为1.07%～7.19%。见表5。

图5倍硫磷及其5种代谢产物紫外吸收光谱

表4倍硫磷及其5种代谢产物的线性范围和灵敏度

2.8样品稳定性实验

分别配制质量浓度为2.00、10.00和50.00 mg/L的倍硫磷及其5种代谢产物混合加标血浆，分别放置于4℃和-40℃冰箱中保存，在配制当时、24 h以及第3、7天分别测定样品，每个时间点每组检测6个样品，以配制当时测定结果为基准，计算存放不同时间后的回收率。结果表明，4℃保存条件下Ⅰ和Ⅱ在血浆中极不稳定，3 d内快速分解，Ⅲ在血浆中可能由其他组分分解产生，随时间延长有增多的趋势，其他成分相对稳定，随保存时间延长缓慢分解，见表6。-40℃保存条件下Ⅱ仍不稳定，其他成分在7 d内相对稳定，见表7。建议在实际检测过程中获取血浆样品后尽快进行液液萃取以防部分成分分解，如不能立即萃取需要尽快置于-40℃冰箱冻存，以防分解。

表5倍硫磷及其5种代谢产物的加标回收率和精密度

表6 4℃保存不同时间倍硫磷及其5种代谢产物的回收率

表7-40℃保存不同时间倍硫磷及其5种代谢产物的回收率

3、讨论

大多数有机磷杀虫剂沸点较低，挥发性强，气相色谱法或气相色谱-质谱法是有机磷原型主要的检测方法[12-14]。有机磷杀虫剂经体内氧化、还原、水解和结合反应后，代谢产物极性增强，水溶性增大，从而使之容易经肾脏排出体外[15]。但代谢产物一般沸点升高，难以用气相色谱方法同时直接测定有机磷杀虫剂的原型和代谢产物。UPLC方法不受待测物质挥发性的影响，且分离速度较快[16]。本研究结果显示，在6 min内即可完成倍硫磷及其5种代谢产物的分离和检测。色谱-质谱联用方法固然灵敏度高，对于未知样品的定性优势更明显[6,17-18]，但是UPLC方法仪器成本较低，更为普及，且中毒患者生物样品中的有机磷杀虫剂原型和代谢产物浓度相对较高，二极管阵列检测器的灵敏度也足以满足检测要求。

由于血、尿等生物样品基质复杂，在进行检测前需要进行前处理，常用的前处理方法包括液液萃取、固相萃取等技术[19]。本研究中倍硫磷原型为脂溶性物质，而代谢产物大多在有机溶剂和水中有较高的溶解度，单一有机溶剂萃取回收率较低，故考虑使用乙酸乙酯和乙腈混合溶液进行液液萃取的前处理。

本研究建立了液液萃取，UPLC仪检测血浆中倍硫磷及其5中代谢产物的方法，结果显示，该方法操作简便、检测迅速、精密度、准确度和线性关系良好。该方法可用于倍硫磷中毒患者和中毒动物模型内暴露水平的检测和评估，为中毒患者的诊断、治疗和预后评估提供检测技术保障。

作者声明本文无实际或潜在的利益冲突

参考文献:

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基金资助:深圳市科技计划项目(JCYJ20220531091213031);深圳市职业病防治院科研培育计划项目(SZF-PY-2023-003);中华预防医学会中毒控制科研项目(CPMAZD2024006);