位于11号染色体长臂2区3带（11q23）的混合谱系白血病（mixedlineageleukemia,MLL）基因又称KMT2A基因，11号染色体q23位点与其它染色体发生易位、自身串联重复、倒位等均可导致MLL基因重排。该基因重排可发生于急性髓系白血病（AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）等[1]。伴有MLL基因重排的急性白血病大多恶性程度高，缓解率低，对化疗不敏感，患者预后不佳，已成为急性白血病中的一种独特亚型[2],WHO分型将其单独列为11q23/MLL重排白血病组。高通量测序研究发现，在急性髓系白血病中，除了细胞遗传学异常外，同时还伴有多种基因突变，且在白血病的发生、发展以及患者预后评判中起着重要的作用[3]。本研究采用基因组DNA-PCR结合基因组测序技术，对53例伴有MLL重排的AML进行了多种基因突变检测，包括FLT3-ITD、FLT3-TKD、TET2、N-RAS、ASXLI、EZH2、DNMT3、C-Kit、NPM1、WT1、CEBPA等，并评估各种基因突变在MLL重排AML中的发生率及预后意义。

一、材料和方法

入组病例

2006年12月-2014年7月至我院进行染色体核型分析成功的初诊急性白血病患者170例，选取其中53例留有细胞样本的MLL重排AML患者进行突变检测，所有患者均根据临床表现、血常规检查、骨髓细胞形态学、白血病免疫分型、融合基因及染色体核型等检查明确诊断，诊断标准符合《血液病诊断及疗效标准》[4]。

染色体核型分析

采用骨髓细胞直接法和不加刺激剂的24h培养法，按常规制备染色体并采用R显带技术进行核型分析。染色体异常按《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN2016）》的有关规定加以识别和描述[5]。

荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）检测

MLL双色断裂重排探针购自美国AbbottVysis公司，于-20℃保存备用。FISH操作步骤参照说明书进行。使用OlympusBX60荧光显微镜在DAPI/FITC/TexasRed三色滤光镜下观察间期荧光杂交信号：一红一绿一黄色荧光信号者为MLL断裂重排阳性细胞。每例至少分析300个间期细胞（不计重叠细胞），计算阳性细胞比例。

白血病免疫分型

采用流式细胞术间接免疫荧光法和经典法国Immunotech公司生产的单克隆抗体检测白血病细胞的表面抗原。

多重PCR检测

53例患者均进行扩增45种常见白血病融合基因的多重筑巢式PCR检测。

基因组DNA-PCR及基因组测序

按照GenomicDNAminiKit（购自美国Invitrogen公司）说明书操作。从患者骨髓标本或染色体悬液提取基因组DNA。检测吸光度A260/280值以确定DNA的纯度及浓度。PCR扩增应用引物设计采用的软件为SunMicrosystems的Primer6.1软件设计包，针对序列为DNA的外显子区域，引物由上海生工生物工程公司合成（表1）。

每个PCR反应体系为25μl，包括基因组DNA1.5μl(70ng/μl），双向引物各10pmol,MasterTaqMix12.5μl(Tiangen公司），ddH2O加至25μl。PCR反应条件：95℃预变性5min；然后94℃变性30s,55℃-65℃退火30s,72℃延伸40s，循环35-42次，最后72℃延伸10min。用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，紫外光自动成像仪成像。基因扩增产物序列分析PCR产物纯化后进行正、反向测序（由上海裕晶生物科技有限公司协助完成），分析各个基因外显子序列的突变情况。

统计学分析

所有数据均采用SPSS17.0软件进行统计学分析。临床资料统计分析采用χ2检验（分类变量）或t检验（数值变量）检验。P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

染色体分析情况

53例患者中24(24/53）例为t(9;11)(p22;q23）异常核型，其中单纯t(9;11）者12例，变异易位者1例，同时伴有数目异常者8例，以三体8多见，同时伴有数目和结构异常者2例，伴复杂异常者1例。13(13/53）例为t(6;11)(q27;q23）异常核型，其中单纯t(6;11）者6例，同时伴数目异常者1例，同时伴结构异常者2例，同时伴有数目和结构异常者4例。11(11/53）例为t(11;19)(q23;p13）异常核型，其中单纯t(11;19）者8例，同时伴数目异常者2例，同时伴数目和结构异常者1例。2(2/53）例为单纯t(10;11)(p12;q23）异常。1例为单纯t(11;17)(q23;q21）异常。1例为t(11;22)(q23;q13）异常。1例为t(4;11)(q21;q23）异常。

FISH检测结果

53例患者均经FISH证实为MLL基因重排。

多重PCR检测结果

53例患者均进行了多重PCR检测，除1例t(11;22)(q23;q13）因为无相应引物，未能检测到融合基因外，其余患者均检测到相应的融合基因，包括AF4/MLL,AF6/MLL,AF9/MLL,ELL/MLL和AF10/MLL等。

白血病免疫分型情况

53例患者中，45例进行了白血病免疫表型检测，其中26例为髓系表达，17例为髓单核系表达，髓单核系伴B淋系和髓系伴B淋系表达各1例。

突变分析结果

对53例MLL重排AML患者进行了多种AML常见基因突变检测，结果见表2。其中23(23/53,43.39%）例检测到包括9种基因/位点的突变，8例为N-RAS突变，占突变病例的34.78%(8/23），占总病例的15.1%(8/53），核型包括5例t(11;19),2例t(6;11),1例t(9;11)。4例为WT1突变，占突变病例的17.39%(4/23），占总病例的7.5%(4/53)，核型包括3例t(9;11),1例t(6;11）。3例为FLT3-ITD，占突变病例13.04%(3/23），占总病例的5.7%(3/53），核型均为t(9;11）。2例为ASXL1突变，占突变病例的8.69%(2/23），占总病例的3.5%(2/53），核型均为t(9;11)。2例为DNMT3A突变，占8.69%(2/23），占总病例的3.5%(2/53),t(9;11）和t(10;11）核型各1例。1例为FLT3-TKD，占突变病例的4.35%(1/23），占总病例的1.9%(1/53），核型为t(9;11）。1例为FLT3-ITD和FLT3-TKD双突变，占突变病例的4.35%(1/23），占总病例的1.9%(1/53），核型为t(6;11）。C-KIT17及EZH2突变各1例，分别占突变病例的4.35%(1/23）和总病例的1.9%(1/53），核型分别为t(11;19）和t(6;11）。本组病例未检测到CEBPA、NPM1、C-KIT8、TET2等基因突变。病例特点

本组53例伴有MLL重排的AML患者中，男27例，女26例，中位年龄38(3-77）岁。中位白细胞数39.11(1-305.07）×109/L，中位血红蛋白数96(52-157)g/L，中位血小板数58(9-291）×109/L。FAB分型M5最多见（32例），其次为未分类AML(7例）、M4(5例）、M1(5例）和M2(3例）。将53例患者分为突变（23例）和无突变（30例）2组。组间进行比较结果显示，2组患者在发病年龄、性别、白细胞数、血红蛋白和血小板计数等方面并无统计学差异（P>0.05）。53例患者的中位总生存期OS为11个月。突变组中位OS时间为8.5个月，无突变组中位OS时间为13个月，尽管前者生存期短于后者，但无统计学差异。将53例患者根据治疗方法分成仅化疗（35例）和移植（18例）2组进行比较。结果显示，移植组中位OS时间明显长于化疗组（22.5vs7.5个月）（P=0.000）。仅化疗组中，突变组中位OS时间为8.5个月，无突变组为13个月，尽管前者OS短于后者，但无统计学差异。移植组病例中，突变组中位OS时间为13个月，无突变组中位OS时间为23个月，2组OS无统计学差异。本组突变病例中，t(9;11）核型10例，其中位OS时间为17个月（3例失访），t(6;11）核型5例，其中位OS时间为17.5个月（1例失访），t(11;19)7例，其中位OS时间为9个月（2例失访），t(10;11）核型为1例，其生存期为7.5个月。将本组病例分为RAS突变阳性和野生型2组进行比较，结果显示，RAS突变与t(11;19）核型特异相关（P=0.007）,在其它方面2组无统计学差异（P>0.05）；将FLT3-ITD/TKD合并为FLT3突变，再将患者分成FLT3突变阳性和野生型2组进行比较，结果显示，前者血红蛋白水平明显高于后者（P=0.024），在其它方面2组无统计学差异（P>0.05）。将23例突变患者分成FLT3突变组和其它突变组比较发现，前者总生存期（22.5个月）优于后者（9个月），但2者无统计学差异（P>0.05）。

三、讨论

有研究发现，白血病的转化是由基因重排和基因突变2大类遗传学异常共同作用所致[6]。第一类异常为涉及编码受体酪氨酸激酶基因突变，包括FLT3、KIT和RAS等，突变使得造血祖细胞获得增殖和生存优势；第二类异常为涉及转录因子的功能损伤，包括NPM1,CEBPA基因突变和一些融合基因等，异常导致细胞分化受阻并大量蓄积。染色体异常/基因重排和基因突变的检测有助于对AML患者进行精准的危险分层，并选择合适的治疗策略[7]。

11q23/MLL重排是AML中的常见异常，尽管目前发现与11q23/MLL发生重排的染色体或位点达135种之多，但最常见的只有9种，包括t(4;11）、t(6;11）、t(9;11）、t(11;19）、t(10;11）等[8]。本组53例病例中，52例分别属于以上5种异常核型，其中21例（21/53,39.62%）为11q23/MLL重排伴有至少1种额外异常，最常见的额外异常为+8。

大系列11q23/MLL重排AML的多种基因突变研究并不多见。Grossmann等[9]检测了118例11q23/MLL重排AML中16种基因的突变，包括ASXL1、FLT3-ITD、FLT-TKD,K/N-RAS,KIT、NPM1、CEBPA、WT1、BRAF、CBL、RUNXL1、PTPN11、TP53、IDH1和IDH2等。结果显示，该组病例总的突变发生率为57.6%(68/118），大多数病例仅含有一种基因突变。其中最常见的为RAS通路基因突变，包括N-RAS:22%(26/118),K-RAS:20.3%(24/118),FLT3-ITD:4.3%(5/117),FLT-TKD:8.8%(10/113）。研究还发现，K-RAS和N-RAS互相排斥，极少同时发生在同一患者。ASXL1和WT1突变发生率分别为4.5%(5/110）和6.2%(6/97），未检测到NPM1、CEBPA和KIT突变。本研究对53例MLL重排AML进行了11种基因突变检测，包括ASXL1、FLT3-ITD、FLT-TKD,N-RAS,KIT、NPM1、CEBPA、WT1、DNMT3A、EZH2、TET2等。病例总的突变检出率为43.39%(23/53），发生突变的病例中95.7%(22/23）仅含有一种突变，其中最常见的为RAS通路基因突变，包括N-RAS:15.1%(8/53）和FLT3:9.43%(5/53);ASXL1和WT1突变发生率分别为3.5%(2/53）和7.5%(4/53）；未检测到NPM1、CEBPA突变，这与Grossmann等[9]报道基本一致。另外，本组病例中检测到1例KIT和1例EZH2突变（1.9%,1/53），未检测到TET2突变。RAS突变是AML中常见的分子异常，关于在MLL重排AML中的发生率文献报道不尽相同。Yang等[10]报道1组AML病例中，10例为11q23/MLL核型，N-RAS突变发生率为50%(5/10）。Dohner等[11]报道11q23/MLL重排AML中K-RAS和N-RAS突变发生率分别为20%左右。Bacher等[12]报道2502例AML中77例为MLL重排，N-RAS发生率仅为3.9%(3/77）。推测检测位点的不同可能是造成RAS突变发生率不同的原因之一。

Grossmann等[9]报道，WT1和FLT3-ITD突变与t(11;19）/MLL-ELL,K-RAS突变与高白细胞计数，ASXL1突变与低血红蛋白水平具有特异相关性。Driessen等[13]报道，伴MLL重排婴儿白血病中RAS突变与初诊时高的白细胞计数特异相关。本组病例的临床特点与文献报道不尽相同，10例t(9;11）/MLL-AF9未检测到N-RAS突变，8例N-RAS突变患者核型均为t(11;19）/MLL-ENL，且统计学分析结果显示，N-RAS突变与t(11;19）/MLL-ENL具有特异相关性（P=0.007),3/4例WT1突变和2/3例FLT3-ITD患者为t(9;11）核型，尽管例数较少，无法进行统计学分析，但似乎这2种突变更易发生于t(9;11）核型。本组5/8例RAS突变患者中有白细胞资料，中位白细胞数为21.39×109/L，与野生型N-RAS病例白细胞数相比，无统计学差异（P>0.05）。5例FLT3突变与野生型FLT3患者相比，前者血红蛋白水平显著高于后者（P=0.024），而1/2例ASXL1突变患者有血红蛋白资料，为96g/L，因病例数少，无法进行比较。Chou等[14]报道，ASXL1在异常核型AML中发生率为12.9%，该突变与患者高龄、男性、染色体+8、RUNX1、HLA-DR和CD34表面抗原具有相关性，本组中2例ASXL1突变患者均为>60岁的女性，核型均为t(9;11）异常，且其中1例同时伴有+8,2例均表达HLA-DR，但无CD34表达。

根据细胞遗传学和分子突变结果，将AML分成低危、中危和高危不同的风险组。在11q23/MLL重排AML患者的预后分层中，除t(9;11）为中危组外，其它的异常均为高危组[11]。各种基因的分子突变可发生于正常核型，也可与异常核型同时发生，不同的基因突变对预后有不同的影响。本组病例中突变患者中位生存期为8.5个月，无突变患者为13个月，2者之间无统计学差异。RAS信号通路基因（RAS,FLT3）突变是11q23/MLL重排AML中的常见分子异常，但Grossmann等[9]和Lavallée等[15]均发现，该类突变并不影响MLL重排AML患者的生存期。其中N-RAS突变患者中位生存期为5个月，N-RAS野生型患者为11个月，尽管前者生存期短于后者，但二者比较无统计学差异。本组5例FLT3突变患者中位生存期为22.5个月，其它突变患者中位生存期为9个月，前者生存期长于后者，但差异没有统计学意义。由此推测，伴有FLT3突变者较其它突变患者预后相对良好。这可能与前者血红蛋白较高有关，但因为病例数较少，无法得出明确结论。另外，本组病例中检测到2例ASXL1、1例KIT、1例EZH2和1例DNMT3A突变，伴有这些突变的患者生存期均较短。尽管有文献报道这些基因突变在AML中一般患者预后不良，但因为例数较少，无法进行统计学分析，故无法得知这些突变是否能影响11q23/MLL重排核型的预后意义[14,16,17,18]。

对本组53例11q23/MLL重排病例进行多因素分析发现，行造血干细胞移植可使该类患者获得较好预后，其中位生存期显著长于仅化疗患者（P=0.000），核型、突变与否对其并无影响。

综上所述，本组病例具有以下特点：11q23/MLL重排AML核型常合并其它附加异常，最常见的为+8；该类患者突变发生率较高,多为单一突变，RAS通路基因突变最为常见；N-RAS突变多见于t(11;19）异常核型；FLT3突变患者血红蛋白水平高于野生型患者；本组患者预后不良，但突变对本组患者的总生存期并无影响；造血干细胞移植可使该类患者获得较好疗效。

参考文献：

[4]张之南,沈悌.血液病诊断及疗效标准.3版.北京:科学出版社.2007:106-116.

[7]尹佳,孙爱宁,田孝鹏.急性早幼粒细胞白血病中常见白血病基因突变的检测及其临床意义.中国实验血液学杂志,2013;21(1):39-44.

白淑潇,公艳蕾,张静人,吴春晓,张俊,仇惠英,沈红杰,岑建农,陈苏宁,潘金兰.53例伴有11q23/MLL重排的急性髓系白血病的常见基因突变[J].中国实验血液学杂志,2020,28(03):717-723.