免疫性血小板减少症是一种获得性、高度异质性的自身免疫介导的血液系统疾病。ITP的发病机制中同时存在血小板的破坏增多和生成不足。血小板自身抗体的形成在其中发挥着重要作用。既往认为抗体引起的血小板破坏主要是依赖于网状内皮系统Fc受体介导的吞噬作用。目前研究发现,ITP还存在Fc-非依赖性血小板清除途径,如血小板自身抗体引起的血小板凋亡和血小板的去唾液酸化等[1,2,3]。血小板是一种无核细胞,以线粒体跨膜电位的去极化为特点的内源性凋亡途径是影响血小板寿命和存活率的主要凋亡方式[4]。其中,B细胞白血病/淋巴瘤-2(B-cellleukemia/lymphoma-2,Bcl-2)家族蛋白中促凋亡和促存活成员的平衡在血小板凋亡过程中起到关键作用[5]。影响Bcl-2家族的生理性和病理性因素较多,其中,ITP血浆中血小板自身抗体可通过多种途径引起促凋亡蛋白和促存活蛋白的表达或活性改变,加速血小板的凋亡,导致血小板破坏增多[1,6,7]。此外研究还发现,不同阶段的ITP血小板凋亡程度也存在差异[8,9]。基于对ITP血小板凋亡的研究不断深入,目前国内外关于ITP一线和二线治疗药物对血小板凋亡影响的研究也日益增多。本文结合血小板凋亡的最新研究进展,对血小板凋亡在ITP的发病和治疗中的作用作一综述。

1、血小板的凋亡及其调节机制

1.1细胞凋亡及其主要途径

细胞凋亡又称为细胞程序性死亡,是一种主动的、程序性的细胞死亡方式,受基因、酶类及相关信号转导途径等调控。线粒体是细胞的能量工厂,为细胞生存提供能量。与此同时,线粒体也是细胞凋亡调控的活动中心,在细胞凋亡通路中发挥重要角色。细胞的凋亡过程分为开始阶段和效应阶段,前者分为线粒体介导的内源性途径和死亡受体介导的外源性途径,两条途径最终均通过激活半胱氨酸天冬氨酸酶家族引起细胞凋亡[5]。

1.1.1内源性凋亡途径

主要经由Bcl-2家族蛋白调控,Bcl-2家族主要分为3类:①促凋亡蛋白:包括Bak1和Bax,可直接作用于线粒体,导致细胞凋亡;②促存活蛋白:包括Bcl-2、人bcl-xL(鼠Bcl-xL)和MCL1等,可通过抑制人BAK1(鼠Bak1)和人BAX(鼠Bax)活化促细胞存活;③仅含BCL2同源结构域(BCL2homologyregion3,BH3)蛋白:包括BIM、BID和BAD(小鼠Bad)等,凋亡信号(如DNA损伤)可通过转录上调或转录后修饰等方式激活仅含BH3域蛋白,使之结合于促存活蛋白和促凋亡蛋白,最终间接引起细胞凋亡[5]。内源性凋亡途径通过Bak1和Bax活化,触发线粒体外膜的透化(mitochondrialoutermembranepermeabilization,MOMP)过程,引起△Ψm去极化,导致细胞色素C(cytochrome-c,CytC)释放,进一步启动以caspase-9为启动子的凋亡瀑布,最终激活凋亡的效应子caspase-3和caspase-7。Caspase家族是内源性凋亡途径的执行者,介导与凋亡相关的标志性事件,如DNA碎裂、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)暴露和质膜出泡等[5]。

1.1.2外源性凋亡途径

死亡受体(FAS)与相应配体(FASLG等)结合后,衔接蛋白募集在死亡受体胞内结构域(死亡域),活化caspase-8,在Ⅰ类细胞(如淋巴细胞)中,caspase-8可激活caspase-3和caspase-7直接诱导细胞凋亡;在Ⅱ类细胞(如肝细胞)中,则由活化的caspase-8首先激活BID,后者进一步诱导促凋亡蛋白BAK1(Bak1)和BAX(Bax),通过内源性凋亡途径诱发细胞凋亡。

1.2血小板寿命的决定因素

生理状态下,血小板的寿命在人类约为8～9d,在小鼠约为5d。血小板的寿命受多种因素影响,目前已知的诱导血小板凋亡的刺激因素包括生理性刺激因素和病理性刺激因素两大类。前者主要包括高血流剪切力、血小板储存条件;后者主要包括高剂量的凝血酶、钙离子载体A23187以及免疫、感染等疾病状态等[7,10,11]。近些年的研究显示,发生在血小板的凋亡和血小板表面聚糖的降解均是决定血小板寿命的两个关键机制[2,3,10,12]。本文主要关注其中的凋亡因素在血小板寿命及ITP疾病过程中的作用和影响。

1.3血小板凋亡及其调控因素

血小板是无核细胞,研究证实血小板含有凋亡所需的多种蛋白质,其线粒体和核糖体使其具备一定的蛋白质合成功能。目前大量研究证实,血小板的寿命和在体内的生存率主要由血小板的内源性凋亡机制决定,其中,Bak1和Bax是引发血小板凋亡的主要因子,前者存在于线粒体中,后者主要存在于胞质中,受到诱导凋亡的因素刺激(如DNA损伤)后转移至线粒体,同时促使线粒体通透性转变孔(mitochondrialpermeabilitytransitionporin,MPTP)开放,使△Ψm下降,引起CytC的释放,最终诱导细胞凋亡[8]。而在生理状态下,BAK1(Bak1)和BAX(Bax)的活性受制于Bcl-2家族中的bcl-xL(Bcl-xL)。bcl-xL(Bcl-xL)也被证实为血小板中唯一参与拮抗促凋亡蛋白的Bcl-2家族成员,bcl-xL(Bcl-xL)是在巨核细胞成熟末期转移至血小板前体,随出芽最终全部转移至血小板,与之相对,小鼠和人体血小板中均未检测到Bcl-2的表达。动物实验发现,当小鼠的Bcl-XL基因发生突变后,血小板寿命会缩短到1.0～3.5d,同时敲除Bak1和Bax基因后,血小板寿命可提高2倍,可挽救因Bcl-XL表达不足导致的血小板减少[13]。

此外,仅含BH3蛋白成员中的BAD(Bad)也可间接导致血小板发生凋亡。Zhao等[14]研究发现一种高表达于血小板内的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶-PKA可以通过改变其活性影响BAD(Bad)第155位丝氨酸的磷酸化,调控BAD(Bad)与BCL-XL(Bcl-XL)的结合,最终达到调节BAK1(Bak1)和BAX(Bax)促凋亡活性的作用。PKA作为调控血小板内源性凋亡的上游调节因子,其活性受抑制后,BAD(Bad)的第155位丝氨酸磷酸化,14-3-3从BAD脱落并释放入胞质,使BAD(Bad)可与BAK1(Bak1)和BAX(Bax)竞争结合BCL-XL(Bcl-XL),导致BCL-XL(Bcl-XL)无法抑制BAK1(Bak1)和BAX(Bax)活性,后者可进一步经由MOMP过程活化caspase-3和caspase-7,引起不可逆的凋亡。在肿瘤化疗领域,首个与BAD具有相似活性的BH3类抗肿瘤药物ABT-737以及在2008年已进入临床试验研究的ABT-263均可以通过结合Bcl-2和bcl-xL等促存活蛋白达到诱导细胞凋亡的作用,但是上述药物由于同时抑制bcl-xL而影响血小板的寿命,引起药物相关血小板减少[15]。随着药物治疗学的发展,目前新一代抗肿瘤药物ABT-199作为Bcl-2特异性的BH3类抗肿瘤药物,因其对bcl-xL蛋白具有相对较低的亲和力,因此仅抑制造血系统中依赖于Bcl-2存活的肿瘤细胞,而不会对依赖于bcl-xl存活的血小板产生显著影响[16]。另外,有研究发现,体外储存的过程中,p38MAPK和p38MAPK介导的磷脂酶A2活化后导致花生四烯酸从膜磷脂表面释放,致使14-3-3从BAD脱落并与血小板内膜处GPⅠbα胞质区结合,同样可以导致上述过程的发生[17]。

体外储存的血小板bcl-xL(Bcl-xL)水平下降,Mason等[13]发现小鼠衰老的血小板Bcl-xL水平明显减少,导致促凋亡蛋白活性无法受到抑制,进而诱发血小板过早凋亡。而血小板缺乏功能性细胞核,BCL-XL(Bcl-XL)等Bcl-2家族成员的表达和翻译是无法通过DNA转录或复制层面进行调控的[18]。而血小板富含大量mRNA,其中微小RNA(microRNA,miRNA)作为一种微小的高度保守非编码蛋白质的RNA,具有调节mRNA转录的功能[19]。Ple等[20]发现人类血小板含有超过492种miRNA。血小板是以miRNA作为复杂调控网络的中心环节,miRNA作为翻译调控子在储存血小板的凋亡中起重要作用,体外储存的血小板寿命主要受BCL-XL影响,而后者的表达主要由miRNA调节。Yu等[18]通过生物信息学技术分析得到,人血小板miRNA中miR-326的靶基因是BCL-XL,因其与荧光素酶分析显示的种子区完全互补可与BCL-XLmRNA的3'-UTR区直接结合,而miRNA与其他BCL2家族基因均为间接作用。研究发现,miR-326的过表达可以增加BCL-XLmRNA表达和蛋白质水平;相反,抑制miR-326的过表达则可以增加BCL-XLmRNA和蛋白表达的水平[21]。

1.4血小板凋亡的检测指标

血小板作为一种无核细胞,线粒体对血小板的能量代谢起到重要作用。血小板凋亡主要经线粒体介导的内源性途径发生[4]。目前常用于评估血小板凋亡的检测指标可按血小板的不同区域进行划分。

1.4.1线粒体层面

△Ψm去极化被认为是细胞凋亡级联反应中的初始阶段,为不可逆事件,也是MOMP的标志性事件,继发于MPTP的形成,最终导致线粒体内促凋亡物质的释放和活化,△Ψm去极化可通过流式细胞学技术对JC-1标记的血小板线粒体进行检测[4]。

1.4.2胞质层面

活化的caspase-3是血小板内源性凋亡途径的主要执行者,由caspase家族中的启动者即活化的caspase-9激活,介导后续的DNA核碎裂、PS暴露和质膜出泡等过程,多数引起血小板凋亡的生理或病理因素可引起caspase-3的活化[5]。但也有研究发现血小板中存在不依赖caspase-3的凋亡过程,可能的机制是一种钙依赖的中性蛋白酶Calpain酶切caspase-3的活化位点,抑制caspase-3的活化,而同时替代其发挥降解细胞内蛋白的作用[15]。Caspase-3的活化可通过流式细胞学技术对DEVD-FMK或VAD-FMK标记的活化caspase-3进行检测[1,7,9]。

1.4.3质膜层面

PS暴露为细胞凋亡早中期最明显的标志,是凋亡不可逆转后引起的血小板质膜改变,作为凋亡血小板发出的“吃我”信号,PS暴露的血小板被吞噬细胞识别,完成对凋亡血小板的清除过程,可采用流式细胞学技术对AnnexinV标记的暴露的PS进行检测[22]。

1.4.4细胞整体层面

此为血小板凋亡的终末阶段,血小板最终皱缩并脱落形成质膜包裹的类似凋亡小泡的形态,也称为微粒,可通过流式细胞学技术对这种血小板微粒进行定量测定以及血小板皱缩的判读[4]。

2、血小板凋亡在ITP发生和发展中的作用

2.1血小板凋亡与成人ITP的关系

Piguet和Vesin等首先发现抗血小板抗体可引起小鼠血小板的caspase-3活化增加、微粒形成和血小板寿命缩短[1]。Leytin等[11]进一步证实抗GPⅡb抗体可引起小鼠血小板凋亡增加。此后研究证明成人慢性ITP(chronicITP,CITP)存在血小板凋亡,且这种凋亡现象在抗GPⅡb-Ⅲa抗体和(或)抗GPⅠbⅨ抗体阳性的患者中发生比例更高,血小板凋亡程度与血小板计数及网织血小板计数均呈负相关;此外,体外实验表明,正常人血小板与成人CITP血浆或从患者血浆中提取纯化的IgG孵育后其凋亡相关标记物较正常人血浆孵育后增加[7]。Qiao等[6]通过体外实验证明正常人血小板与成人ITP的血浆孵育后凋亡标记物升高,伴BCL-XLmRNA和bcl-xL蛋白的表达下调,同时观察到BAXmRNA和BAX蛋白的表达上调,提示BCL-XL和BAX的表达失调可能参与ITP的血小板凋亡过程。Deng等[8]研究也证实,成人CITP可检测到血小板凋亡,伴Bcl-2家族中的BCL-XLmRNA表达下调、BAXmRNA和BAKmRNA表达上调,蛋白水平bcl-xl/BAK和bcl-xl/BAX的比值均下降。Chen等[10]对成人ITP的血小板及体外实验均发现抗GPⅠbα抗体可引起PKA活性降低,导致血小板凋亡,PS的暴露介导血小板在肝脏被巨噬细胞吞噬。

2.2血小板凋亡与儿童ITP的关系

首先,在儿童急性ITP(acuteITP,AITP)中,Winkler等[9]发现该人群中存在血小板凋亡现象,与健康儿童和化疗相关性血小板减少症(chemotherapy-inducedthrombocytopenia,CIT)患儿相比,出现活化的caspase-3/8/9、PS暴露的血小板比例明显增多,而血小板微粒形成在ITP和CIT两组间无显著差异,△Ψm在各组间均无显著差异。而对儿童CITP的研究发现,其血小板凋亡标记物与正常儿童相比均无显著增加,且抗体阳性组和抗体阴性组CITP儿童的血小板凋亡现象也无显著差异,进一步研究还发现,儿童CITP存在血小板CXCR4表达显著升高和Akt的活化,其中Akt活化是抑制细胞程序化死亡的经典途径中的关键环节,推测儿童CITP因CXCR4的升高使血小板对凋亡耐受[23]。

3、ITP治疗药物对血小板凋亡的调控

3.1人静脉注射丙种球蛋白(IVIG)对血小板凋亡的调控

自1981年,Imbach等首次提出大剂量IVIG可用于儿童ITP的治疗后,随着临床研究的进展,IVIG始终在儿童和成人ITP的诊疗指南中列为ITP的一线治疗选择[24,25,26]。对于IVIG治疗ITP血小板减少的机制,最初认为主要通过封闭网状内皮系统的FcγRⅡB,抑制吞噬细胞对抗体吸附的血小板的吞噬[27]。近些年,有人提出IVIG还有调节ITP患者血小板和巨核细胞凋亡的作用。其中,Leytin等[11]发现给抗GPⅡb阳性的ITP小鼠模型注射IVIG后可以明显抑制血小板的caspase-3活化和PS暴露。Winkler等[9]通过观察儿童急性ITP接受IVIG治疗后血小板凋亡标记物的变化得出结论,IVIG可以改善儿童ITP的血小板凋亡现象(caspase-3活化和PS暴露),但△Ψm无明显改变,这一点与Leytin等的体外实验结果相符,提示IVIG并不影响上游的△Ψm去极化过程,而是直接影响下游的凋亡途径,此外,该研究还发现IVIG能够同时降低caspase-8和caspase-9的活化,推测IVIG可以同时抑制内源性和外源性凋亡途径[9]。

3.2血小板生成素和促血小板生成素受体激动剂类药物对血小板凋亡的调控

随着对ITP发病机制的认识深入,发现ITP同时存在血小板的破坏增多和生成不足两条途径,因此在ITP的治疗领域逐渐出现了国内研制的血小板生成素(recombinanthumanthrombopoietin,rhTPO)和国际上广泛应用的促血小板生成素受体激动剂(thrombopoietinreceptoragonists,TPO-RA)两类促血小板生成类药物,目前在ITP的诊疗指南中将这类药物列为ITP的二线治疗[24,25,26]。近些年的研究发现,rhTPO和TPO-RA类药物也可影响血小板的凋亡。Erhardt等[28]首先通过体外实验发现,rhTPO可以通过激活AKT途径达到抑制血小板凋亡的作用。此后,Mitchell等[29]发现通过口服一种小分子非肽类TPO-RA类药物艾曲波帕,成人ITP患者的血小板对促凋亡药物ABT-737的敏感性可显著降低,同时也观察到AKT通路的活化,但是这种效应仅出现在艾曲波帕治疗的1周内,是一种暂时性的治疗反应。Goette等[7]也发现艾曲波帕治疗后成人ITP的血小板△Ψm的去极化现象显著改善,证明艾曲波帕可能抑制血小板的凋亡。但与上述结论相反,Alvarez等[30]发现艾曲波帕和罗米司亭这两种TPO-RA类药物均无法改善ITP患者血小板PS暴露的现象。因此,对于促血小板生成类药物对血小板凋亡的调控还有待进一步研究。

4、总结

ITP是一种高度异质性的血小板减少疾病,不同人群中血小板减少的发病机制的差异导致其对治疗的反应存在差异,临床结局和预后也截然不同。对于ITP发病机制的认识深入将有助于个体化治疗策略的制定和调整。本文总结了目前国内外对于血小板凋亡在ITP发生、发展和治疗中影响的研究进展,明确了成人和儿童ITP中均有血小板凋亡的参与,但不同病程和预后的ITP之间仍存在血小板凋亡的差异,进一步证明了ITP的异质性。同时,尽管国际上对于IVIG和促血小板生成类药物治疗ITP的效果十分肯定,但两类药物在改善ITP血小板凋亡方面的机制仍不十分清楚,尚需进一步的研究。

参考文献：

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