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老年急性髓系白血病分子学特征及临床意义

2020-10-17 210 上传者：管理员

摘要：目的:研究老年急性髓系白血病(AML)患者分子学特征及临床意义。方法:借助双脱氧链终止测序方法研究52例老年AML患者的分子学特征，结合临床资料分析51个血液病相关基因的突变情况及临床意义，并对39例接受DCAG方案化疗的患者进行疗效分析。结果:老年AML患者有较高的突变频率[98.1%(51/52)]，不同的突变基因之间存在一些共存或互斥现象。突变个数随着年龄增长而增加，表观遗传学突变DNMT3A、TET2(P<0.01)及FLT3-ITD(P<0.05)发生率亦随着年龄增长而增高。c-KIT突变在低危核型组AML最常见(P<0.01)，而NPM1和DNMT3A等突变则常见于中危组(P<0.05)，尤其在核型正常的AML中多见。接受DCAG方案化疗的老年AML患者有较高的完全缓解率[71.8%(28/39)]。结论:老年AML患者具有特定的分子学特征，甲基化相关基因突变发生率较高，这对临床诊疗有一定的指导意义。

关键词：
临床诊疗
基因测序
老年急性髓系白血病
血液科
表观遗传学突变
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急性髓系白血病是由不同的致癌因子之间复杂的相互作用产生的一类遗传异质性疾病，其发病率及预后均与患者年龄直接相关，其中老年患者约占70%，中位发病年龄68岁[1,2,3]。相比年轻患者，老年AML患者预后较差，与患者身体状况弱、伴随基础疾病多、化疗耐受性差，以及不良染色体核型(-5/5q-、-7/7q-以及复杂核型等)发生率高等因素有关[1,4]。近年来，基因组学的研究使AML的分子发病机制及克隆演变等逐渐被发现，其中一些基因突变如FLT3-ITD、NPM1和CEBPA等已被纳入NCCN指南，用于指导临床预后，且表观遗传学基因如DNMT3A、TET2和ASXL1等突变参与AML发生发展的机制及对预后的影响亦得以证实[5,6,7]。研究认为NPM1mut/FLT3-ITDneg和DNMT3A突变分别是中危核型老年AML的独立预后较好及不良因素[8]。然而，目前国内对于老年AML患者的相关研究仍较少。本研究拟对52例初治老年AML患者行二代测序，结合临床资料分析，探讨老年AML患者预后不良的分子学机制及对临床疗效的影响，以期为老年AML患者的临床诊治提供一定指导。

1、材料和方法

1.1老年AML患者的临床特征

本研究所选的52例初治老年AML患者来自解放军总医院和清华长庚医院，这些患者均为denovoAML，诊断前无疑似骨髓增生异常综合征病史。于2010-2018年诊断明确且均有二代测序分析资料，根据FAB诊断标准，包括除M3外的各型AML。其中有50例患者做了核型分析，依据NCCN指南(2020.V3)预后分类标准，包括低危核型AML2例(4%)，中危核型AML34例(68%)，其中正常核型有19例(38%)，高危核型AML14例(28%)，未知核型AML2例(4%)。52例患者临床相关信息见表1。

1.2基因突变测序分析

根据现有的AML突变基因研究，选取51个血液系统疾病相关基因对52例患者初诊时的骨髓标本进行二代测序分析，其中包括ClassⅠ基因(FLT3、KIT、NRAS、KRAS和PTPN11等)、ClassⅡ基因(NPM1、CEBPA、RUNX1、GATA2和ETV6等)、表观遗传修饰类(DNMT3A、TET2、IDH1/2、ASXL1和EZH2等)、肿瘤抑癌基因类(WT1、PHF6和TP53)、剪切因子类基因(U2AF1、SRSF2和SF3B1)、黏附复合物类基因(STAG2和RAD21)和NOTCH家族类等突变[5,9,10,11]。收集标本库中52例患者初诊时的骨髓标本，进行基因组DNA提取、文库构建、目标区域捕获测序及数据分析，并对产物进行Sanger测序以对结果进行筛选和突变验证。

1.3治疗情况

在52例老年AML患者中，8例因身体状况较差仅接受姑息治疗或因经济情况拒绝化疗。5例接受传统诱导化疗，即标准“3+7”方案(3d蒽环类药物+7d阿糖胞苷)。另外39例接受含去甲基化药物(hypomethylatingagents,HMA)的DCAG方案化疗:地西他滨10mg/m[2],d1-5;阿克拉霉素20mg,d1,3,5;阿糖胞苷10mg/m[2],q12h,d1-5;G-CSF300μg/d,d0开始直至粒细胞恢复正常。行DCAG方案化疗的39例患者中，共有28例经1或2个周期诱导治疗后达到完全缓解，这部分患者缓解后仍以DCAG作为巩固化疗方案直至疾病复发、进展或难以承受的化疗副反应，2个周期DCAG化疗后未缓解的患者则更换为其他治疗方案。其他支持治疗包括升血药物应用、输注悬浮红细胞及血小板、抗感染等对症支持治疗。

1.4统计学分析

本研究使用SPSS19.0软件进行统计学分析，连续变量的比较用t检验或u检验，计数资料率的比较用Pearson’sχ2检验或Fisher’s精确检验。CR定义为骨髓原始细胞数<5%，且中性粒细胞绝对值≥1.0×109/L、血小板数>100×109/L;部分缓解(partialremission,PR)定义为骨髓原始细胞数为5%-20%;没达到CR或PR被认为是未缓解(nonremission,NR);复发定义为外周血可见白血病细胞或骨髓原始细胞数重现>5%。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1老年AML患者的突变频率及突变分布

52例老年AML患者中，51例发生突变，突变率为98.1%。突变发生频率在10%及以上的基因共有11个，分别为:DNMT3A突变频率占32.7%(17/52),CEBPA基因突变占30.8%(16/52),FLT3-ITD突变频率占25%(13/52),TET2基因突变占23.1%(12/52),NPM1基因突变占19.2%(10/52),ASXL1突变频率占17.3%(9/52),RUNX1突变频率占15.4%(8/52),IDH2突变频率占13.5%(7/52),CBLC、NRAS和SRSF2占11.5%(7/52)(图1)。

分析突变谱发现，一个样本往往同时有几个突变，同一个基因在相同的样本中亦可出现不止1次突变。不同的突变基因之间存在一些共存或互斥现象，即一些突变通常伴随出现在同一个样本中，比如NPM1与FLT3-ITD和/或DNMT3A突变，10例NPM1突变阳性患者中，9例同时伴有DNMT3A突变，7例伴有FLT3-ITD突变，NPM1mut/FLT3-ITDmut/DN-MT3Amut共突变的患者共7例，且全部为中危核型AML。而有些突变却互斥存在，以CEBPA和NPM1基因为例，16例CEBPA突变阳性的患者中，无一例同时伴发NPM1突变。此外，同类突变基因之间也是互斥的，以表观遗传学突变为例，IDH1/2与TET2突变未在同一AML患者中发现。同样，17例DNMT3A突变阳性的患者中，无一例同时伴有ASXL1突变。

2.2突变与年龄分组之间的关系

突变个数随着年龄增长而增加，以70岁为分界，年龄≤70岁患者≥3个的突变频率为23.3%(10/43),>70岁患者≥3个的突变频率为88.9%(8/9)。2个年龄组的突变基因及频率亦有一定的差异。以表观遗传学突变为例，DNMT3A和TET2突变在年龄>70岁AML组有相对较高的发生率，分别为88.9%和55.6%，而在年龄≤70岁组分别为20.9%和16.3%,2组比较差异均具有统计学意义(P<0.01)。FLT3-ITD突变亦在年龄>70岁AML组有较高的发生率，为55.6%，与年龄≤70岁组的发生率(18.6%)比较，差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

2.3突变与染色体核型分组之间的关系

不同核型组的突变基因有一定差异，对几个常见基因与核型即预后分组之间的关系进行分析。结果发现，KIT突变在低危核型组患者中最常见，本研究4例KIT突变阳性患者中，2例为均低危核型(50%)。而NPM1和DNMT3A等突变则常见于中危组，尤其是在核型正常的AML中多见。本研究的10例NPM1突变阳性患者中，全部为中危核型，其中8例伴正常核型(80%);17例DNMT3A突变阳性的AML中，13例预后中危(76.5%)，其中10例为正常核型(76.9%)(表3)。

2.4接受DCAG化疗患者的疗效分析

在39例接受DCAG化疗的患者中，经过1个周期化疗总反应率(overallresponserate,ORR)为76.9%。其中，23例(59%)达到CR,7例(17.9%)达到PR，其中4例PR患者经第2程化疗后达到CR,1例经第3程化疗达到CR。相比之下，7例接受标准化疗或姑息治疗的中危核型患者中仅1例达到CR(14.3%)(P=0.003)。9例接受DCAG化疗未缓解的患者中，3例为中危核型同时伴有NPM1mut/FLT3-ITDmut/DNMT3Amut3个突变。而分析另外4例NPM1mut/FLT3-ITDmut/DNMT3Amut3个突变的患者发现，除1例接受DCAG化疗的患者达到CR外，其余3例接受IA/MA标准诱导化疗的患者均为NR。结合染色体核型分析，低危核型组的2例患者均达到CR(100%),24例中危核型AML患者中18例达到CR(75%),13例高危核型AML患者中8例达到CR(61.5%)。

3、讨论

AML是由造血干/祖细胞的获得性遗传与表观遗传学改变引发的一种恶性疾病。近年来，随着分子诊断技术水平的提高，在基因水平上对AML的分子学发病机制及预后分层有了更深入的认识[5,12,13,14,15,16]。然而，现有研究多局限于年轻AML患者，尤其国内关于老年AML的研究相对较少。随着老龄化社会的到来，老年AML的发病率逐年增高，但由于患者脏器功能差、合并症多以及体能状态弱等问题，可选择的治疗方案有限，患者往往又对传统治疗方案耐受性差，且疗效欠佳，易发生耐药、复发等[1,17,18]。因此，亟需深入研究老年AML的分子学机制及寻找副作用小、疗效好的治疗方法。

本中心纳入52例初诊老年AML患者，借助二代测序方法研究51个血液病相关基因的突变情况，结合临床资料分析其临床意义，并对39例接受DCAG方案化疗的患者进行疗效及预后分析。关于该方案治疗老年AML患者的疗效及安全性，在本中心前期研究工作中均有详细介绍[19,20]。本研究结果显示，老年AML患者突变频率高达98.1%,52例患者中仅1例患者没有发现突变，且年龄越大，突变的个数越多。共有7个基因突变率在15%以上(DNMT3A、CEBPA、FLT3-ITD、TET2、NPM1、ASXL1和RUNX1)。某些基因的突变率高于国外的研究[5,21]，出现这样结果的可能原因有2个:一是病例的选择，因为52例患者中大部分为中危核型AML，而某些基因的突变率与核型有关，本文结果部分已具体分析;二是种族因素，恶性肿瘤中非随机染色体异常的地域分布不均现象此前已有报道，该现象反映了种族或环境因素的差异，基因突变的分布同样也可显示出地理差异[22,23]。不同的突变基因之间存在一些共存或互斥现象，本研究结果显示NPM1与FLT3-ITD、DNMT3A突变常出现在同一样本中。10例NPM1突变阳性AML患者中，9例同时伴有DNMT3A突变，7例伴有FLT3-ITD突变。3者共突变的发生率也较高，NPM1mut/FLT3-ITDmut/DNMT3Amut共突变的患者共7例，且全部为中危核型，而无1例患者同时出现CEBPA和NPM1突变。同类突变基因之间也是互斥的，以表观遗传学突变为例，无1例患者同时出现IDH1/2与TET2突变，DNMT3A和ASXL1突变亦不同时出现在同一患者。这一发现可以用突变基因的生物学功能来解释，即协作发生的突变往往属于不同分类的基因，而彼此互斥的突变在生物学功能上表现为对造血转化具有共同的机制[24,25]。这样的协作和互斥模式表明了各种突变及其组合在AML发病机制中的一定作用，但需将来更多的基础研究来进一步证实。

本研究结果还显示，表观遗传学突变DNMT3A、TET2、ASXL1和IDH2等的发生率在老年AML患者中较高，DNA甲基化及去甲基化突变DNMT3A和TET2的发生率随着年龄增长而增高。国外研究证实，表观遗传类突变可作为指导HMA疗效的标志物[19,26,27]。其中常见的HMA之一地西他滨是嘧啶类似物，主要通过作用于DNA甲基化转移酶，使DNA发生去甲基化，诱导沉默的抑癌基因重新被激活，从而起到抑制肿瘤的作用[28]。研究认为伴此类突变的患者往往对HMA的疗效反应较好[27,29,30]。一些研究认为，HMA单药虽较传统方案提高了老年AML患者的OS，但存在反应率低、难以达到持续缓解及失败后二次治疗效果欠佳等问题[31,32]。HMA与其他药物联合应用是目前研究的热点。近年来，国内多个研究证实，DCAG方案用于治疗老年AML取得了较好疗效。Li等[33]研究85例接受DCAG方案诱导化疗的老年初治AML患者的结果显示，1个疗程后ORR率可达82.4%,CR率达64.7%，且诱导死亡率仅4.4%。2个分别针对510例及890例患者的Meta分析结果亦均证实，DCAG方案较单用CAG方案可显著提高老年AML的ORR率和CR率[34,35]。Huang等[36]对接受DCAG和标准剂量化疗的老年AML患者的研究显示，2组有相近的ORR率和CR率。虽然DCAG组多数患者年龄较标准化疗组年龄更大、身体状况更差，但2组的OS和无复发生存期相似，且DCAG组有更低的感染率和更短的血小板恢复时间。本研究中39例接受DCAG化疗的老年AML患者ORR率为76.9%,CR率为71.8%，与以上结果相似。

综上所述，高通量测序技术的应用使AML发生发展的分子生物学机制及基因型与临床表型之间的关系被逐渐证实。本研究借助二代测序技术分析了52例老年AML患者的基因突变情况，为深入理解其生物学特点及指导临床治疗提供了一定依据。DCAG方案对老年患者是安全有效的，或许可以作为一线化疗方案。鉴于本研究是单中心、回顾性研究，且病例数有限，尚需多中心、大规模前瞻性临床研究进一步证实，以期实现老年AML的精准分层和诊疗。

参考文献:

[34]杨乾,王晓东,赵奎君,等.地西他滨联合CAG方案治疗老年急性髓系白血病的临床疗效Meta分析.中国现代医生,2018,56(9):13-16.

[35]郭怀鹏,李国辉,陈仁安,等.CAG治疗老年急性髓细胞白血病疗效和安全性的Meta分析.临床血液学杂志,2018,31(11):850-853.

汪变红,关伟,吕娜,金香淑,李停,于力,靖彧.老年急性髓系白血病分子学特征及临床意义[J].中国实验血液学杂志,2020,28(05):1445-1450.

基金:国家自然科学基金(81670162);北京清华长庚医院研究基金(12017C1016).