结直肠癌是世界范围内第三大常见恶性肿瘤，也是全球第二大癌症相关死亡原因。结直肠癌高发于50岁以上人群，其致死人数占癌症相关死亡总人数的9.4%[1]。手术和化疗是结直肠癌的主要治疗手段，但二者的副作用及化疗的耐药性严重影响了患者的治疗效果[2]。因此，开发新的结直肠癌治疗方法和抗结直肠癌药物具有重要的意义。

熊果酸（ursolic acid,UA）是一种天然的三萜类化合物，广泛存在于山茱萸、泽兰等多种中药中，具有抗菌、抗炎、镇静等生物活性[3]。近年来研究者发现，UA对结直肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤细胞（如HCT-116、SW480细胞）的生长具有抑制作用[4―5]，其纳米脂质体在脑肿瘤及脑转移瘤患者中表现出较好的疗效及较高的安全性，且已进行了相关临床试验[6]，但目前关于UA抑制结直肠癌的具体机制尚不明确。p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK）信号通路是细胞应对各种胞外刺激的主要传感通路之一，能刺激细胞增殖、分化、凋亡等恶性生物学行为，在多种恶性肿瘤的发生发展中具有重要作用[7]。基于此，本研究以人结直肠癌SW620细胞为对象，进一步验证UA的抗结直肠癌作用，并基于p38 MAPK信号通路探讨其可能的分子机制，旨在为UA的临床应用及抗结直肠癌的药物开发提供参考。

1、材料

1.1主要仪器

本研究所用主要仪器有SYNERGY-H1型多功能酶标仪（美国Bio Tek公司）、Novo Quanteon型流式细胞仪（美国ACEA Biosciences公司）、Chemi Doc Touch型高灵敏度化学发光成像仪（美国Bio-Rad公司）、BX53+DP72型正置成像显微镜（日本Olympus公司）、Galaxy 170S型细胞培养箱（德国Eppendorf公司）等。

1.2主要药品与试剂

UA对照品（批号MUST-20061105，纯度≥98%）购自成都曼斯特生物科技有限公司；p38 MAPK抑制剂SB203580（批号HY-10256，纯度99.96%）购自美国MCE公司；DMEM培养基和胎牛血清（批号分别为C11995500BT、10099141）均购自美国Gibco公司；基质胶（批号354234）购自美国Corning公司；二甲基亚砜（批号D2650）购自美国Sigma公司；膜联蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）/碘化丙啶（propidium iodide,PI）凋亡试剂盒、CCK-8试剂盒（批号分别为40302ES60、40203ES80）均购自上海翊圣生物科技有限公司；4%多聚甲醛固定液（批号AR1068）购自武汉博士德生物技术有限公司；结晶紫染色液（批号C0121）购自上海碧云天生物技术有限公司；兔源磷酸化p38 MAPK(phosphorylated p38 MAPK,pp38 MAPK）、p38 MAPK、B细胞淋巴瘤2(B cell lym‐phoma 2,Bcl-2）、多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]、上皮钙黏素（E-cadherin）、神经钙黏素（N-cadherin）、锌指转录因子Snail、β-微管蛋白（β-tubulin）单克隆抗体（批号分别为4631S、9212S、4223S、9532S、3195S、13116S、3879S、2148S）和RIPA细胞裂解液、3×蛋白上样缓冲液（批号分别为9806S、7723S）均购自美国CST公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔Ig G二抗（批号1706515）购自美国Bio-Rad公司；蛋白酶抑制剂Cocktail、磷酸酶抑制剂Phos STOP（批号分别为05892791001、04906837001）均购自上海罗氏制药有限公司；BCA蛋白定量试剂盒（批号23227）购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3细胞

人结直肠癌SW620细胞（批号CC0503）购自广州赛库生物科技有限公司。

2、方法

2.1细胞的培养

将SW620细胞接种到含10%胎牛血清、100 U/m L青霉素和100μg/m L链霉素的DMEM培养基（以下简称“完全培养基”）中，在37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。待细胞融合至80%时，用0.25%胰酶消化、传代（消化方法下同），取对数生长期的细胞进行后续实验。

2.2药液的制备

取UA对照品适量，用二甲基亚砜溶解，配制成100mmol/L的贮备液，分装后，于-20℃下保存，备用。取SB203580适量，用二甲基亚砜溶解，配制成20 mmol/L的贮备液，分装后，于-20℃下保存，备用。

2.3 UA干预时间和干预浓度的选择

取对数生长期的SW620细胞，以1×104个/孔接种到96孔板中，培养；次日，分别加入含不同浓度UA[0（空白组，下同）、5、10、15、20、25、30μmol/L，浓度参考相关文献[4]设置]的完全培养基，作为实验组（每组设3个复孔）。培养24、48、72 h后，每孔加入CCK-8试剂10μL，孵育1 h后，采用酶标仪于450 nm波长下测定其吸光度（A）值并计算细胞存活率[细胞存活率（%）=实验组A值/空白组A值×100%]。

2.4细胞克隆形成率的检测

取对数生长期的SW620细胞，以500个/孔接种到6孔板中，培养；次日，分别加入含不同浓度UA(0、10、15、20μmol/L，浓度根据“2.3”项下结果设置，下同）的完全培养基，作为实验组（每组设3个复孔）。培养10 d后，弃去上清液，细胞用4%多聚甲醛固定30 min，以结晶紫染色30 min，用水冲洗后，记录每孔中的克隆数[大于50个细胞的集落计为1个克隆]并拍照，计算克隆形成率[克隆形成率（%）=克隆数/接种细胞数×100%]。

2.5细胞凋亡率的检测

取对数生长期的SW620细胞，以2×105个/孔接种到6孔板中，培养；次日，分别加入含不同浓度UA(0、10、15、20μmol/L）的完全培养基，作为实验组（每组设3个复孔）。培养24 h（培养时间根据“2.3”项下结果设置，下同）后，消化，收集细胞并用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤2次，以1×binding buffer 100μL重悬，再依次加入An‐nexinⅤ-FITC染液5μL和PI染液10μL，避光孵育15min，以1×binding buffer 400μL稀释，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率（包括早期凋亡率和晚期凋亡率）。

2.6细胞侵袭能力的检测

用无血清DMEM培养基稀释基质胶（基质胶与培养基的体积比为1∶8），取上述混合物60μL包被Tran‐swell小室，于37℃下孵育1 h。取对数生长期的SW620细胞，饥饿24 h后，用无血清的DMEM培养基制成1×106个/m L的细胞悬液。取上述悬液200μL，将其分别与含不同浓度UA(0、10、15、20μmol/L）的无血清DMEM培养基混匀，作为实验组（每组设3个复孔），接种于Transwell小室上层；取含20%胎牛血清的DMEM培养基600μL，置于Transwell小室下层；培养24 h后，取出Transwell小室，收集穿膜细胞，用4%多聚甲醛固定30min，用水清洗2次，再以结晶紫染色30 min。在正置显微镜下随机选取4个视野，记录穿膜细胞数，取平均值以表示细胞的侵袭能力。

2.7细胞中相关蛋白表达的检测

采用Western blot法进行检测。取对数生长期的SW620细胞，以2×105个/孔接种到6孔板中，培养；次日，分别加入含不同浓度UA(0、10、15、20μmol/L）的完全培养基，作为实验组（每组设3个复孔）。培养24 h后，收集细胞，提取其总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒测定其浓度后，进行变性处理。取变性蛋白35μg，经电泳分离后转膜，以5%脱脂牛奶于室温下封闭1 h；加入通路相关蛋白（p-p38 MAPK、p38 MAPK）、凋亡相关蛋白（Bcl-2、PARP）、上皮间质转化相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Snail）、β-tubulin一抗（稀释比例均为1∶1 000），于4℃下孵育过夜；加入相应二抗（稀释比例为1∶3 000），于室温下孵育1 h；用ECL化学发光超敏显色试剂盒显色，并置于高灵敏度化学发光成像仪下成像。使用Image Lab 5.2.1软件进行分析，以目的蛋白与内参蛋白（β-tubulin）的灰度值比值表示目的蛋白的表达量，以pp38 MAPK与p38 MAPK的表达量比值表示p38 MAPK蛋白的磷酸化水平，结果以空白组为参照进行归一化处理。

另取对数生长期的SW620细胞，以2×105个/孔接种到6孔板中，培养；次日，将细胞分为空白对照组、SB203580组、UA组和SB203580+UA组（每组设3个复孔）。空白对照组细胞加入完全培养基，SB203580组细胞加入含SB203580(10μmol/L，浓度参考相关文献[8]设置，下同）的完全培养基，UA组细胞加入含UA(15μmol/L，根据“2.4”项下结果，选择能够显著影响细胞生物学行为的浓度，下同）的完全培养基，SB203580+UA组细胞加入含SB203580和UA(10μmol/L+15μmol/L）的完全培养基。培养24 h后，按上述Western blot法检测各组细胞中p-p38 MAPK、Bcl-2、N-cadherin、β-tubulin蛋白的表达量，结果以空白对照组为参照进行归一化处理。

2.8统计学方法

采用Graph Pad Prism 8软件对数据进行统计分析并作图。实验结果采用表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni法。检验水准α=0.05。

3、结果

3.1 UA的干预浓度和干预时间

与空白组比较，经5～30μmol/L UA作用24、48、72h后，细胞的存活率均显著降低（P<0.05），且有浓度依赖趋势。后续选择UA干预浓度10、15、20μmol/L，干预时间24 h进行实验。结果见图1。

图1 UA对SW620细胞存活率的影响

3.2 UA对SW620细胞克隆形成率的影响

与空白组比较，15、20μmol/L UA组细胞的克隆形成率均显著降低（P<0.05），且20μmol/L UA组显著低于10、15μmol/L UA组（P<0.05）。结果见图2、表1。

图2 UA对SW620细胞克隆形成的影响

表1各组细胞克隆形成率、凋亡率和穿膜细胞数比较

3.3 UA对SW620细胞凋亡率的影响

与空白组和10μmol/L UA组比较，15、20μmol/L UA组细胞的凋亡率均显著升高（P<0.05），且20μmol/L UA组显著高于15μmol/L UA组（P<0.05）。结果见图3、表1。

图3 UA对SW620细胞凋亡率影响的流式图

3.4 UA对SW620细胞侵袭能力的影响

与空白组比较，10、15、20μmol/L UA组的穿膜细胞数均显著减少（P<0.05），且15、20μmol/L UA组显著少于10μmol/L UA组（P<0.05）。结果见图4、表1。

图4 UA对SW620细胞侵袭能力影响的显微图

3.5 UA对SW620细胞中相关蛋白表达的影响

与空白组比较，15、20μmol/L UA组细胞中Bcl-2和N-cadherin蛋白的表达量均显著降低，裂解型PARP(cleaved-PARP）蛋白的表达量和p38 MAPK蛋白的磷酸化水平均显著升高（P<0.05);20μmol/L UA组细胞中Snail蛋白的表达量显著降低，E-cadherin蛋白的表达量显著升高（P<0.05）。与10μmol/L UA组比较，15、20μmol/L UA组细胞中Bcl-2蛋白的表达量均显著降低（P<0.05);20μmol/L UA组细胞中cleaved-PARP、E-cadherin蛋白的表达量均显著升高，Snail蛋白的表达量显著降低（P<0.05）。与15μmol/L UA组比较，20μmol/L UA组细胞中Bcl-2蛋白的表达量显著降低，cleaved-PARP蛋白的表达量显著升高（P<0.05）。结果见图5、表2。

图5 UA对SW620细胞中凋亡、上皮间质转化、p38MAPK信号通路相关蛋白表达影响的电泳图

表2各组细胞中凋亡、上皮间质转化相关蛋白表达量和p38 MAPK蛋白磷酸化水平比较

3.6 p38抑制剂对UA作用后SW620细胞中相关蛋白表达的影响

与空白对照组比较，UA组细胞中p-p38 MAPK蛋白的表达量显著升高，Bcl-2、N-cadherin蛋白的表达量均显著降低（P<0.05);SB203580组细胞中p-p38 MAPK蛋白的表达量显著降低（P<0.05）。与UA组比较，SB203580+UA组细胞中p-p38 MAPK蛋白的表达量显著降低，Bcl-2、N-cadherin蛋白的表达量均显著升高（P<0.05）。结果见图6、表3。

图6 p38抑制剂对UA作用后SW620细胞中p-p38MAPK、Bcl-2、N-cadherin蛋白表达影响的电泳图

表3各组细胞中p-p38 MAPK、Bcl-2、N-cadherin蛋白表达量比较

4、讨论

天然植物提取物具有多样的生物活性，与化学合成药物相比，其毒副作用更低，已成为抗肿瘤药物的重要来源[9]。UA广泛存在于多种植物中，具有抗氧化、抗菌、保护肝脏、调节免疫、抑制肿瘤、保护心脏和调节血脂等多种药理作用[10―11]。本研究结果显示，UA可显著抑制SW620细胞的生长、侵袭和转移，促进其凋亡，进一步明确了UA的抗结直肠癌作用。

细胞凋亡是一种程序性细胞死亡过程，是多细胞生物维持自身稳定的重要生理机制，大量研究表明，诱导肿瘤细胞凋亡的药物是恶性肿瘤预防和治疗的重要手段[12―14]。Bcl-2作为经典的抗凋亡蛋白，能通过减少细胞色素C从线粒体释放来发挥抑制细胞凋亡的作用；PARP也是凋亡相关调控分子，被切割后，即cleavedPARP，可通过进一步激活胱天蛋白酶3来诱导细胞凋亡[15]。本研究结果显示，UA可通过抑制Bcl-2蛋白的表达和促进cleaved-PARP蛋白的表达来诱导SW620细胞凋亡，提示其对SW620细胞生长的抑制作用可能与诱导该细胞凋亡密切相关。

上皮间质转化是指上皮细胞摆脱细胞间黏附，转化为更具运动能力和侵袭能力的间质细胞的生物过程，这一过程往往涉及E-cadherin表达下调、N-cadherin和锌指转录因子Snail表达上调等[16]。上皮间质转化是上皮细胞起源的肿瘤细胞获得迁移、侵袭能力的重要恶性生物学过程，是促进肿瘤转移的重要机制[16]。本研究结果显示，UA可通过抑制Snail、N-cadherin蛋白的表达，促进E-cadherin蛋白的表达，从而抑制SW620细胞的侵袭，进一步揭示了UA的抗结直肠癌作用具有多靶点、多途径的特点。

p38 MAPK信号通路是MAPK家族的重要组成部分。Jia等[17]研究发现，经荷叶黄酮干预后，肺癌A549细胞中p-p38 MAPK蛋白的表达上调，进而促进了该细胞的凋亡；Dai等[18]研究发现，在肺腺癌细胞中，抑制p38MAPK蛋白的表达可增强肿瘤细胞的侵袭活性。由此可见，p38 MAPK信号通路在肿瘤细胞凋亡和侵袭过程中具有重要作用。本研究结果显示，UA可上调SW620细胞中p38 MAPK蛋白的磷酸化水平。为进一步验证，本研究考察了p38 MAPK抑制剂SB203580与UA联用对SW620细胞中Bcl-2、N-cadherin蛋白表达的影响，结果显示，SB203580可抑制UA对p38 MAPK蛋白表达的上调作用，逆转UA对Bcl-2、N-cadherin蛋白表达的抑制作用。

综上所述，UA可以抑制SW620细胞的生长、侵袭和转移，并诱导其凋亡，其作用机制可能与激活p38MAPK信号通路相关。

参考文献:

[3]陈燕,何沙,陈春林.熊果酸药理作用研究进展[J].宜春学院学报,2023,45(9):21-26.

[15]于菲,罗卓,黎骊,等.氯化两面针碱通过PI3K/Akt/Bcl-2/caspase-3/PARP通路诱导小细胞肺癌细胞H1688和H446凋亡[J].中国药理学通报,2022,38(7):1023-1031.

基金资助:广州市科技计划项目(No.202201020320);

文章来源:石尧,汪晴,张骏鸿,等.熊果酸对人结直肠癌SW620细胞恶性生物学行为的影响及机制[J].中国药房,2024,35(18):2252-2257.