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CROI2019研究实现HIV储存库清除及功能性治愈

2020-06-23 676 上传者：管理员

摘要：反转录病毒和机会感染会议(CROI)是艾滋病及机会性感染领域的顶尖会议，为全球艾滋病的预防、治疗和治愈提供了一个高水平的学术交流平台。近年来，研究者致力于通过各种方法实现艾滋病功能性治愈。功能性治愈意味着艾滋病病毒(HIV)感染者接受一定时长的治疗后最大限度地抑制HIV复制，同时将HIV储存库减少至可控程度，保证机体免疫功能维持正常水平。2019年CROI会议中呈现了许多令人瞩目的实现HIV储存库清除及功能性治愈的研究进展，本文对此进行总结报道。

关键词：
CROI会议
HIV病毒载量
功能性治愈
感染性疾病
抗反转录病毒疗法
艾滋病病毒储存库
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尽管联合抗反转录病毒疗法(combined antiretroviral therapy,cART)可有效抑制艾滋病病毒（HIV）复制，使HIV病毒载量维持在极低水平[1]。但cART仍不能彻底清除HIV，一旦cART停止，HIV核糖核酸（RNA）便会迅速反弹。HIV难以根除的关键是HIV储存库的持续存在[2]。HIV感染者需终身服用抗病毒药物以抑制病毒储存库中HIV表达。然而，长期服用药物给HIV感染者带来的不良反应、相关歧视以及经济影响，提示亟待探究清除HIV储存库及实现功能性治愈的新策略。2019年3月4-7日，在美国西雅图举行了著名的反转录病毒和机会感染会议(Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections,CROI)，此次会议涉及HIV的预防、检测、诊断和治疗等领域，现将会议中HIV储存库清除及实现功能性治愈的相关研究总结如下。

1、免疫疗法清除HIV储存库

HIV以具有复制能力的HIV脱氧核糖核酸（DNA）整合到感染细胞的基因组中形成储存库[3-4]。细胞在静息状态时，整合HIV DNA转录沉默，由于病毒蛋白表达很少或不表达，潜伏感染细胞可逃避免疫识别[5]。识别并清除HIV储存库，才有机会实现真正意义的艾滋病（AIDS）功能性治愈。

清除HIV储存库的一种策略是使用潜伏期反转剂（latency reversing agents,LRAs）激活病毒转录，诱导蛋白表达和病毒粒子产生，随后，细胞可能通过病毒诱导的细胞病变或免疫清除策略而死亡以达到HIV储存库清除的目的[6]。迄今为止，已发现可激活HIV储存库的LRAs包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂，组蛋白甲基转移酶抑制剂，DNA甲基转移酶抑制剂，蛋白激酶C激动剂等[7]。2019年CROI会议中Judith团队的研究指出，在HIV主要潜伏场所CD4+T淋巴细胞（简称CD4细胞）中，各细胞亚群对LRAs的反应不同。Judith使用巨大戟醇（ingenol,ING），薯司他丁-1(bryostatin,BRY），罗米地辛（romidepsin,RMD），帕比司他（panobinostat,PNB），小分子抑制剂（bromodomain inhibitor,JQ1）等LRAs刺激新鲜分离的CD4细胞，培养22天后检测不同CD4细胞亚群中HIV RNA及p24表达，同时使用BLISS模型计算化合物间的协同或拮抗作用。结果显示，CD4细胞中10.74%的HIV储存库再活化后可诱导表达HIV RNA，但只有10.1%的再活化细胞表达产生了p24蛋白。进一步分析发现，高水平表达的HIV RNA和p24由ING、RMD和PNB诱导，其次是由BRY和JQ1诱导。此外，相比于阴性对照，RMD与ING联合使用可使HIV储存库再活化效率提高3.5倍。在CD4细胞亚群中，多数记忆亚群可被RMD激活，并且在效应记忆T细胞（effector memory T cells,TEM）中表现出最高的易感性（FC=4.24）。PNB在激活中心记忆T细胞（central memory T cells,TCM)(FC=2.11)和TEM(FC=2.32）方面具有较高效率，而ING则在TCM(FC=4.05）和过渡记忆T细胞（transitional memory T cells,TTM)(FC=5.27）中表现出更高的激活效率。LRAs联合使用方面，RMD+ING联合使用在TTM中具有良好的协同作用（FC=6.72）。相反，当PNB+ING组合时，会在HIV转录过程中发生拮抗作用。该项研究结果表明，现有的LRAs在诱导所有潜伏细胞活化过程中效率有限，亟待开发一种能够覆盖CD4细胞所有亚型的广谱诱导活化新药，以更好地实现HIV储存库激活与清除策略[8]。

此外，Maud团队探索了一种新的LRA用于HIV储存库激活与清除策略，该策略模仿线粒体衍生的第二种半胱氨酸天冬酶激活剂（secondmitochondria-derivedactivatorofcaspases,Smac）选择性激活非典型的NF-κB途径（non-canonical NF-κB,ncNF-κB）。Smac是存在于线粒体并调节细胞凋亡的蛋白质，其通过逆转凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis,IAPs）来实现促细胞凋亡作用[9]。已有研究证实，Smac模拟物可促进肿瘤细胞凋亡[10]，那么，Smac模拟物是否可以作为HIV储存库的激活剂呢？Maud等[11]使用一种新型小分子IAP抑制剂AZD5582作为Smac的模拟物，以猴免疫缺陷病毒（SIV）感染的恒河猴（RM）作为研究对象，所有RMs均接受cART一年且病毒载量已被控制在了极低水平。取12只RMs每周进行3～10次100μg/kg剂量的AZD5582静脉注射作为实验组，另外选取9只RMs注射安慰剂作为对照组。注射完成后纵向测量血浆中病毒载量（plasma viral loads,PVL）同时检测外周血、淋巴结、脾脏和骨髓中分离出的静息CD4细胞中SIV DNA及细胞相关的SIV RNA。另外，该研究利用流式细胞术进行了T细胞活化分析，并评估了AZD5582治疗后的基因表达谱和SIV特异性的T细胞应答。研究结果表明，在不引发T细胞大量活化情况下，Smac模拟物AZD5582可激活体内ncNF-κB通路并诱导cART中SIV RNA持续高水平表达，提示潜伏期反转。这一发现为HIV储存库的免疫清除提供了新策略。

除探究高效广谱的潜伏期反转剂之外，找到HIV储存库相关的免疫检查点进行靶向治疗将有可能降低HIV储存库水平。已知HIV作为一种专性的细胞内病原体，必须依赖宿主的细胞机制来完成其生命周期，因此，研究c ART抑制的HIV感染者CD4细胞转录标志物与HIV储存库之间的关系，可以揭示与HIV持续存在相关的重要宿主特征。Wim团队[12]使用RNaseq对69名c ART抑制1～2年的HIV感染者CD4细胞进行全基因转录组分析。通过实时荧光定量聚合酶链反应（q PCR）方法检测细胞相关的HIV RNA,总量HIV DNA和2-LTR表达以表征HIV储存库水平。结果显示，HIV DNA,RNA和2-LTR分别与5,141个和15个基因的表达水平显著相关。ST3GAL5(q<0.002 2）和PDCD1(q<0.00 3 1）基因与总量HIV DNA水平呈正相关。本研究鉴定出的HIV RNA水平相关蛋白标志物数量更多，涉及NFAT信号通路，p53,NOTCH信号通路，RIG-I和EDG1诱导的T细胞损伤等过程中多种蛋白。HIV 2-LTR水平与MAD2L2表达显著相关（q<0.004 1)。此外，研究结果显示c ART启动时间与469个基因具有相关性，涉及途径包括：m TOR,p53,IL2诱导的STAT5和MYC信号通路。Wim团队[12]的研究揭示了宿主基因参与的通路与HIV持续存在的关系。HIV DNA与编码PD-1的PDCD1基因表达之间的强正相关证实T细胞衰竭是HIV持续存在的潜在机制。ST3GAL5基因产物催化GM3产生，GM3是细胞增殖、运输和存活的重要调节因子，这一发现与细胞增殖决定储存库规模的结论一致。这些结果证实了早期和晚期c ART的启动对CD4细胞功能深远和持续的影响，同时确定了PDCD1,ST3GAL5等几个潜在的免疫治疗靶点。明确以上免疫检查点参与HIV储存库维持的具体机制，将为联合免疫治疗实现HIV功能性治愈提供新的理论基础。

2、基因编辑技术的应用

随着高效cART在药物不良反应和病毒清除及疾病治愈过程中的局限性日益凸显，基因编辑技术应用于AIDS治疗的策略备受关注。最近开发的序列特异性基因组编辑工具CRISPR/cas9，为清除或减少HIV储存库提供了新方法。基因靶向策略可针对整合的HIV DNA进行破坏、抑制或激活。然而，该策略的实施需要通过一种体内递送CRISPR/cas9方法完全覆盖HIV储存库。

此次CROI会议中Tricia H团队[13]展示了一种基于CRISPR/cas9基因编辑技术在恒河猴中消除SIV能力的研究成果。该团队使用SIVmac239病毒株静脉感染成年恒河猴（n=8），感染8周后每天使用替诺福韦+恩曲他滨+多替拉韦联合抗病毒治疗。使用AAV-9作为载体递送CRISPR/cas9靶向跨越LTR和GAG基因的序列，体外对PBMCs进行基因编辑，利用移码突变造成整合SIV DNA前病毒失活。随后通过PCR及Sanger测序法评估AAV9-CRISPR-cas9对SIV DNA的清除力和精确度。结果显示，在所有SIV感染的恒河猴中，通过AAV9-CRISPR-cas9基因编辑技术可实现整合SIV DNA的基因敲除，且敲除位点位于LTR和GAG基因序列区间。与对照组相比，使用AAV9-CRISPR-cas9转导的实验组细胞培养物中未检测到病毒生长。Tricia H团队[13]的研究首次证明了CRISPR/cas9技术在靶向SIV原病毒LTR和Gag区域的高度特异性，该技术可对SIV DNA整合基因编辑。这些观察结果支持CRISPR/Cas9技术作为SIV储存库清除策略的潜在用途，值得进一步研究。

3、中和抗体的应用

近年来，在实现HIV功能性治愈的探索过程中，研究者将目光投向了在HIV预防、治疗和疫苗设计中均有重要作用的中和抗体（neutralizing antibodies,nAbs）。中和抗体被认为是目前治疗HIV感染cART的补充免疫疗法。由于其单特异性，在大多数HIV感染者中，使用单一nAbs可导致病毒突变体快速选择逃逸，因此使用2个或更多nAbs组合可保持对HIV复制的持久性抑制[14-16]。2019年CROI会议中Amarendra团队[17]介绍了他们的最新研究。Amarendra团队设计了一种可与三个独立的HIV包膜决定因子（1.CD4+T结合位点;2.膜近端外部区域；3.V1V2-聚糖位点）相互作用的三特异性抗体，该抗体具备一个完整的IgG1骨架结构。为探究该特异性抗体的作用，该团队选用HIV感染者的CD4细胞进行体外实验，与此同时，选用SIV感染的恒河猴进行抗体注射实验用于评估其对病毒复制的抑制作用。结果显示，三特异性抗体的三个结合位点均可与HIV包膜糖蛋白高效结合。同时，三特异性抗体可与FcγR受体结合，引发抗体依赖性细胞毒性和吞噬作用。在HIV感染者活化状态CD4细胞的体外实验中，三特异性抗体与单一抗体相比可持续抑制病毒的复制。在感染病毒性SIV的恒河猴中，用三特异性抗体治疗可将血浆病毒载量降低1 000倍。Amarendra团队的实验结果表明，三特异性HIV抗体在体外表现出有效的中和作用和抗体依赖性细胞毒性，并在体内调节抗病毒活性。因此，该三特异性抗体为治疗HIV感染提供了一种新的有前景的单一免疫治疗蛋白。

此外，Hongzhao Li团队[18]通过对肯尼亚一组接受cART的性工作者进行研究，开发了一种针对第12个蛋白酶裂解位点（protease cleavage sites,PCS）周围序列的新型艾滋病毒疫苗。使用VGV载体，PCS疫苗，gag/env疫苗，纳米PCS疫苗分别免疫SIV感染的猕猴模型以评估PCS新型疫苗的作用。免疫接种完成后，每两周用SIVmac251(250TCID50）阴道内感染疫苗接种和对照组的猕猴，直到大多数对照组猕猴被感染。结果显示，在6次阴道内感染实验中，PCS疫苗和gag/env疫苗均能显著保护猕猴免受致病性SIVmac251感染（P=0.04）每次暴露的风险降低80%以上。Hongzhao Li的研究结果显示，靶向第12个蛋白酶裂解位点周围序列的PCS疫苗，在调节黏膜炎症环境的同时产生免疫反应可能是作为有效预防艾滋病的关键。

4、小结与展望

在c ART时代艾滋病已经成为了一种可以控制的慢性疾病，但长期服药带来的药物不良反应，经济负担以及HIV感染者承受的心理负担等均提示实现艾滋病功能性治愈迫在眉睫。治愈艾滋病最大的障碍是HIV储存库的存在，清除病毒储存库或使病毒储存库降到最低程度，才能更好地实现功能性治愈。本文中报道了2019年CROI会议中最新的有关清除HIV储存库的疗法，包括新的储存库激活策略以及CRISPR/cas9基因编辑策略。此外，中和抗体的应用以及HIV疫苗的研发为艾滋病的防治、实现功能性治愈点燃了新的希望。自2010年以来，在鉴定具有特殊广度和效力的中和抗体方面取得了重大进展[19]。2019年CROI会议上报道的新型三特异性中和抗体，为HIV疫苗研发凝练了新的思路。本次CROI会议充分覆盖了HIV研究领域热点，包括HIV储存库清除以及功能性治愈探究，相信会议中报道的最新研究成果将推动以上领域的深入发展，为全球实现艾滋病功能性治愈指明新的方向。

荀静娜,卢洪洲. CROI2019:实现HIV储存库清除及功能性治愈的研究进展[J].中国艾滋病性病,2020,05:556-558+548.

基金:国家“十三五”科技重大专项(2017ZX09304027,2017ZX10202101-002);上海市公共卫生临床中心院级科研课题面上项目(KY-GW-2019-13).