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抗磷脂抗体损害子宫蜕膜血管内皮细胞血管形成的机制研究

2024-06-07 33 上传者：管理员

摘要：目的:研究抗磷脂抗体(aPL)对蜕膜组织血管内皮细胞(DVEC)增殖、迁移与血管形成能力的影响。方法:采用细胞免疫荧光鉴定DVEC细胞；CCK-8法检测aPL对DVEC细胞增殖的影响；细胞划痕实验与血管形成实验检测aPL对DVEC细胞迁移与血管生成的影响；实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测aPL对DVEC细胞基质金属蛋白酶2(MMP-2)和血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达的影响；Western blot检测aPL对DVEC细胞中p-ERK、t-ERK、VEGF与MMP-2蛋白表达的影响。结果:aPL能抑制DVEC细胞增殖、迁移与血管形成能力；aPL能抑制DVEC细胞中p-ERK、VEGF与MMP-2表达水平，加ERK激动剂后DVEC细胞中p-ERK、VEGF与MMP-2表达水平明显升高。结论:aPL可通过调控ERK通路减少DVEC细胞中VEGF与MMP-2表达，进而抑制DVEC的增殖、迁移与血管形成能力。

关键词：
APS
ERK通路
抗磷脂抗体
蜕膜组织血管内皮细胞
血管形成
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抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome, APS)是一种以血栓形成、病理妊娠与血小板减少为主要临床症状的非特异性自身免疫性疾病，其主要血清学特征为aPL持续阳性[1]。临床上将无血栓病史，以病理妊娠为主要特征的APS称为产科APS[2]。以往研究认为，母胎界面血栓形成[3]、炎症因子浸润[4]与滋养细胞功能损伤[5]等是aPL造成流产发生的主要原因。最新研究发现，母胎界面血管网络障碍也是aPL引起流产的重要发病机制[6,7],是目前研究的热点与难点。本课题组前期研究证实，aPL可通过中性粒细胞胞外诱捕网抑制滋养细胞侵袭能力，影响胎盘血管重塑，诱发流产发生[8]。母胎界面血管网络是维持胚胎与胎儿血液供应的重要结构与基础，目前关于母胎界面血管网络异常的研究多集中于绒毛外滋养细胞侵袭血管与胎盘血管重塑方面，国内外仍缺乏aPL对子宫蜕膜组织中血管内皮细胞功能损伤的机制研究。因此，研究妊娠早期aPL对子宫蜕膜组织中血管内皮细胞功能的损伤机制，探讨aPL引起流产的潜在发病机制，为产科APS相关流产的治疗提供理论新思路。

1、材料与方法

1.1 主要试剂

M199培养基、Dynabeads、UEA-I和磁珠收集器购自美国Invitrogen公司，DNase IV购自美国Sigma公司，岩藻糖购自美国Sigma-aldrich公司，TRIzol试剂和RT-PCR试剂盒购自日本Takara公司，Matrigel基质胶为美国Corning公司产品，anti-VEGF抗体、anti-MMP-2抗体、anti-ERK/p-ERK抗体为美国CST公司产品，EGF为美国MCE公司产品，Western blot试剂盒购自上海碧云天公司，胎牛血清购自美国Gibco公司，CCK-8试剂盒为日本同仁化学研究所产品。

1.2 方法

1.2.1 IgG纯化

收集20例产科APS患者与相匹配孕周正常妊娠孕妇的新鲜外周血，采用NabTM Protein A Plus Spin试剂盒提取血清中IgG,通过BCA试剂盒测定IgG浓度。

1.2.2 DVEC细胞提取与培养

无菌条件下收集妊娠8～11周健康女性因计划外妊娠选择人工流产的蜕膜组织。参考Gallery等[9]方法，采用UEA-I-Dynabeads免疫磁珠纯化提取蜕膜组织血管内皮细胞(DVEC细胞)。置于含1%青/链霉素、1% ECGs、5%人血白蛋白、2mmol/L谷氨酰胺、40U/mL肝素、40%胎牛血清的M199培养基，37℃、5% CO2培养箱培养。细胞分组：(1)NC组：阴性对照组；(2)aPL组：抗磷脂抗体60μg/mL;(3)N-IgG组：健康孕妇抗体60μg/mL;(4)aPL+EGF组：抗磷脂抗体60μg/mL+EGF 20ng/mL。

1.2.3 DVEC细胞免疫荧光鉴定

DVEC细胞于96孔板内培养，4%多聚甲醛固定20min, 0.1% Triton X-100透膜处理10min, 1% BSA封闭内源性非特异抗原30min, 兔抗人vWF一抗(稀释度为1∶200),4℃孵育过夜，有FITC的荧光二抗(稀释度1∶100),37℃孵育45min, DAPI染细胞核5min, PBS漂洗后封片。

1.2.4 CCK-8法检测aPL对DVEC细胞增殖的影响

制备含0、30、60、120μg/mL aPL的细胞悬浮液，按2×104细胞/孔接种至96孔，于0、6、12、24h取出，每孔加100μL完全培养基和10μL CCK-8溶液，4h后用酶标仪检测450nm波长的OD值。

1.2.5 细胞划痕检测aPL对DVEC细胞迁移面积的影响

接种细胞前，在培养板背面以1cm/线和3线/孔的标准画水平线；将细胞按2.5×105细胞/孔接种于6孔板，待融合至90%左右时，移液枪头垂直于培养板底部横线划痕；PBS冲洗3次，根据实验分组处理细胞，置37℃、5% CO2培养箱培养；于划痕后0h和12h进行拍照，使用Image J软件进行统计与分析。

1.2.6 血管形成实验检测aPL对DVEC细胞成管能力的影响

Matrigel、96孔板与200μL无菌枪头4℃平衡过夜；在冰上向每孔加70μL未稀释Matrigel, 37℃培养箱静置30min; 按实验分组制备细胞悬浮液，每孔加2.5×104个细胞，置37℃孵育箱培养8h; 每孔随机统计8个视野；使用Image J软件进行分析。

1.2.7 RT-PCR检测VEGF、MMP-2表达水平

TRIzol法提取细胞总RNA,紫外分光度计测定RNA浓度和纯度；将RNA逆转录为cDNA;引物序列：VEGF上游：5'-CATCCAATCGAGACCCTGGTG-3';下游：5'-TTGGTGAGTTTGATCCGCATA-3';MMP-2上游：5'-CTCATCGCAGATGCCTGGAA-3';下游：5'-TTCAGGTAATAGGCACCCTTGA-3';GAPDH上游：5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3';下游：5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'。通过RT-PCR扩增，反应条件：预变性95℃ 5min, 1个循环；变性95℃ 30s, 退火延伸60℃ 30s, 40个循环。目的基因表达量采用2-△△Ct表示。

1.2.8 Western blot法检测ERK、VEGF与MMP-2表达水平

收集各组细胞，提取细胞总蛋白，定量2g/L,每泳道30μL蛋白上样，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜至PVDF膜。5% BSA室温摇床封闭2h, 与一抗(anti-VEGF抗体1∶1000;anti-MMP-2抗体1∶1000;anti-ERK/p-ERK抗体1∶2000)4℃摇床孵育过夜。加ECL化学发光剂，经Bio-rad成像，用Image J软件定量分析。

1.3 统计学处理

采用SPSS 23.0统计学软件，计量资料用

表示，采用t检验。每组实验均重复3次。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 DVEC细胞培养

置相差显微镜下观察：细胞最初较红细胞略大，接种4～6h后贴壁，呈长梭形、多角形(图1A),3～5d后可见细胞贴壁生长形成数量不等的细胞集落，一般生长至5～7d时细胞融合成单层细胞(图1B)。传代后，细胞呈环状生长，形似血管。

图1 DVEC细胞镜下形态(100×)

2.2 DVEC细胞免疫荧光鉴定

对纯化的DVEC细胞进行vWF的免疫荧光染色。结果显示，分离出95%以上DVEC细胞的胞质呈黄绿色(图2A),表达vWF,证实是血管内皮细胞。DAPI对细胞核染色，细胞核呈蓝色(图2B),表明细胞纯度较高。图A与B合并后可见“环形血管结构”(图2C)。

图2 DVEC细胞免疫荧光染色(200×)

2.3 aPL对DVEC细胞增殖能力的影响

aPL浓度为30μg/mL、作用DVEC细胞18h时，细胞的增殖能力被显著抑制(P<0.05);当aPL浓度为60μg/mL、作用DVEC细胞12h时，细胞的增殖能力被显著抑制(P<0.01);当aPL浓度为120μg/mL、作用DVEC细胞6h时，细胞的增殖能力显著降低(P<0.01)(图3)。结果表明，aPL作用DVEC细胞时间相同时，随aPL浓度增加，DVEC细胞增殖能力随之下降；除了具有浓度依赖性以外，aPL对DVEC细胞的抑制效应也呈时间依赖性，aPL作用DVEC细胞浓度相同时，随着作用时间延长，DVEC细胞增殖能力随之下降。因此，aPL能显著抑制DVEC细胞的增殖能力，具有浓度与时间依赖性。当aPL浓度在60μg/mL、作用时间为12h时，对DVEC细胞增殖能力的抑制作用显著，选择60μg/mL作为aPL在后续实验中处理DVEC细胞的浓度。

图3 CCK-8法检测aPL抑制DVEC细胞的增殖水平

2.4 aPL对DVEC细胞迁移能力的影响

60μg/mL aPL处理DVEC细胞12h,与NC组、N-IgG比较，aPL组DVEC细胞迁移面积明显减少[(19.57±0.43)% vs (99.30±0.48)%、(98.58±0.36)%,P<0.01],而N-IgG组与NC组比较无显著差异(P>0.05)。表明aPL能抑制DVEC细胞的迁移能力。

2.5 aPL对DVEC细胞成管能力的影响

与NC组及N-IgG组比较，aPL组内DVEC细胞的小管形成数量明显减少、小管结构显著破坏，表现为节点数量、网眼数量显著减少(P<0.01),而NC组与N-IgG组比较无显著差异(P>0.05)。表明aPL能抑制DVEC细胞的成管能力。见表1。

表1 aPL对DVEC细胞成管能力影响的结果统计

2.6 aPL对DVEC细胞VEGF和MMP-2表达水平的影响

与NC组及N-IgG组比较，aPL组DVEC细胞VEGF与MMP-2 mRNA和蛋白表达水平均显著下降(P<0.01),NC组与N-IgG组比较均无显著差异(P>0.05),见图4。

2.7 aPL可通过调控ERK通路抑制DVEC细胞迁移和血管形成

与NC组比较，aPL能显著抑制DVEC细胞中ERK磷酸化水平、细胞的迁移面积、小管节点数目、网眼数目与分支数目(P<0.01);aPL组加入ERK激动剂(EGF)后，DVEC细胞内ERK磷酸化水平升高，aPL对细胞迁移面积与小管形成数量的抑制作用显著被逆转，表现为DVEC细胞迁移面积显著增加，小管的节点数目、网眼数目与分支数目均显著增多(P<0.01);NC组与aPL+EGF组比较，DVEC细胞中ERK磷酸化水平、细胞迁移面积、小管的节点数目、网眼数目与分支数目无显著差异(P>0.05)(图5)。结果表明，aPL可能通过ERK通路参与抑制DVEC细胞的迁移和血管形成过程。

图4 aPL对DVEC细胞中VEGF与MMP-2表达的影响

图5 抗磷脂抗体通过ERK通路抑制DVEC细胞迁移与血管形成

3、讨论

子宫蜕膜组织中血管内皮细胞的生理功能主要包括增殖、迁移与血管形成等，任何过程发生异常都可能造成内皮功能紊乱，影响子宫蜕膜组织血管网络的形成，若发生在孕早期易引发流产，导致妊娠失败[11]。研究表明aPL与流产关系密切[12]。aPL引起流产的发病机制复杂，目前仍未完全清楚。研究发现，aPL能结合滋养细胞、内皮细胞、血小板、单核细胞等多种细胞膜表面的β2糖蛋白I抗原引起滋养细胞功能障碍、胎盘微血栓形成与母胎界面炎症因子浸润等，进而造成流产发生[1]。母胎界面血管网络异常成为产科APS相关流产的重要发病机制，倍受国内外学者的广泛关注。作为母胎界面血管网络的组成部分，子宫蜕膜血管网络在维持胚胎与胎儿血液供应中发挥着重要作用，但目前关于aPL对母体面子宫蜕膜微血管损伤机制的研究甚少。

本研究结果显示，aPL抑制DVEC细胞的增殖能力，并具有浓度和时间依赖性。血管内皮细胞的迁移与血管形成在妊娠早期子宫蜕膜血管网络形成过程中发挥着极为重要的作用。本研究结果显示，与IgG组和NC组比较，aPL组DVEC迁移能力与血管形成能力显著受到抑制。表明aPL显著抑制DVEC细胞的迁移与成管能力。这提示APS患者体内aPL能抑制蜕膜组织血管内皮细胞的增殖、迁移与血管形成能力，是诱发流产的重要原因。因此，计划妊娠前服用药物，可能通过有效降低产科APS患者体内aPL的滴度，防止aPL对子宫DVEC细胞的损伤，避免流产发生。

子宫蜕膜组织中血管内皮细胞血管形成是受多种血管生成因子和相关信号通路调控的[13,14]。VEGF与MMP-2作为促血管生成的重要因子，在内皮细胞血管形成过程中发挥着重要作用[15]。本研究发现，aPL组DVEC细胞中VEGF、MMP-2 mRNA与蛋白表达水平均显著下降，这表明aPL能抑制促血管因子VEGF与MMP-2表达。VEGF与MMP-2作为重要的血管生成因子，在维持子宫蜕膜组织血管内皮细胞功能中发挥着重要的作用，有望成为预测产科APS患者在妊娠早期子宫蜕膜血管内皮细胞功能是否正常的分子标志。

ERK信号传导通路参与肿瘤[16]和胚胎血管[17]的形成过程。作为MAPK重要信号通路之一，ERK信号通路受到不同刺激后传递的信息不同，产生的生物学效应亦有所不同[18]。本研究发现，aPL能显著下调血管内皮细胞中ERK磷酸化水平，但加入ERK激动剂后，ERK磷酸化水平显著逆转，VEGF和MMP-2表达水平升高，DVEC细胞血管形成能力明显改善。这表明aPL可能通过调控ERK信号通路减少血管内皮细胞中VEGF与MMP-2表达，抑制血管内皮细胞的血管形成能力，进而导致妊娠早期子宫蜕膜组织中血管内皮细胞的功能发生异常，引起子宫蜕膜组织血管网络形成障碍，造成流产发生。研究发现，NF-κB参与了aPL抑制子宫蜕膜组织血管内皮细胞的迁移和血管形成过程[9]。这表明aPL抑制子宫蜕膜组织的血管形成是多机制、多通路的。因此，后续研究将对aPL损伤子宫蜕膜组织血管形成的分子机制网络进行全面的剖析。

综上所述，aPL通过调控ERK信号通路抑制DVEC细胞中VEGF和MMP-2表达，损伤子宫蜕膜组织血管内皮细胞的增殖与迁移，进而影响DVEC细胞的成管能力。本研究结果为产科APS的临床治疗提供新思路，丰富和完善了产科APS相关流产分子机制网络。后续实验将从动物水平对aPL抑制子宫蜕膜组织血管网络形成能力及其相关分子机制进行深入的探索与研究。

基金资助:国家自然科学基金面上项目(No:81873842);临沂市重点研发计划(医学类)(No:2022YX0092);

文章来源:张琳琳,郑雪梅,王谢桐,等.抗磷脂抗体损害子宫蜕膜血管内皮细胞血管形成的机制研究[J].现代妇产科进展,2024,33(06):451-455.