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难治性肺炎支原体肺炎患儿T淋巴细胞亚群和HMGB1的表达情况及临床意义

2020-07-30 401 上传者：管理员

摘要：目的:探讨难治性肺炎支原体肺炎(RMPP)患儿T淋巴细胞亚群及高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的表达情况，为临床早期诊断RMPP提供参考。方法:选择2016-2018年在我院儿科接受治疗的肺炎支原体肺炎(MPP)患儿430例，其中RMPP患儿106例(RMPP组)，非RMPP患儿324例(NRMPP组);另选同期体检健康儿童106例(NC组)作为对照组。分析三组儿童的临床资料及T淋巴细胞亚群、淋巴细胞绝对计数、HMGB1、C反应蛋白(CRP)及降钙素原(PCT)等生化指标的差异性;利用ROC评估RMPP的预测指标。结果:与NRMPP组和NC组相比，RMPP组患儿的CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+、CD3-CD19+、CD19+CD23+、CD3-CD(16+56+)绝对值均下降，外周血淋巴细胞绝对计数、HMGB1、CRP及PCT水平均升高(P均<0.05)。ROC分析显示，CD3+CD4+、CD19+CD23+、HMGB1、CRP及PCT水平可预测RMPP，其AUC(95%CI)分别为0.887(0.857,0.917)、0.827(0.788,0.865)、0.907(0.863,0.951)、0.844(0.789,0.898)、0.788(0.727,0.849)，敏感性分别为87%、82%、89%、85%、79%，特异性分别为78%、74%、81%、76%、72%。结论:RMPP患儿T淋巴细胞亚群及血清HMGB1水平升高，提示免疫系统紊乱参与了RMPP的发病过程，故T淋巴细胞亚群及血清HMGB1水平可作为RMPP的预测指标。

关键词：
T淋巴细胞亚群
儿科
难治性肺炎支原体肺炎
高迁移率族蛋白B1
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肺炎支原体肺炎是儿童常见的社区获得性肺炎之一，占CAP患儿的10%～40%[1]。MPP起病可急可缓，伴有头痛、发热、畏寒等症状，初起干咳，后逐渐加重，可伴有喘息，肺部湿啰音出现较晚，具有肺部实质变性体征。近年来越来越多的难治性甚至致命性肺炎支原体(MP)感染病例被报道。难治性肺炎支原体肺炎主要是指MPP经大环内酯类抗生素规范治疗≥7d，仍有持续发热，临床症状及肺部的影像学体征继续恶化[2,3]。引起RMPP的原因是多方面的，包括大环内酯类耐药、病原体感染、免疫功能紊乱和炎症反应等[2,3,4]，过度的免疫及炎症反应在其发病机制中具有重要作用。T淋巴细胞亚群可介导机体的免疫反应，而高迁移率族蛋白B1是巨噬细胞分泌的一种活性促炎细胞因子，参与炎性反应与免疫发病机制[5,6]。本研究拟探讨RMPP患儿T淋巴细胞亚群及HMGB1的表达情况，为临床早期诊断RMPP提供参考。

1、资料和方法

1.1一般资料

选择2016-2018年在我院儿科住院治疗，诊断为MPP的患儿430例，其中RMPP106例(RMPP组)，年龄2个月～13岁，非RMPP324例(NRMPP组)，年龄3个月～14岁。MPP诊断标准[7]:(1)具有发热、咳嗽、气喘等呼吸道症状，胸部X线片存在肺部实质性浸润影;(2)采用颗粒凝集法(PA)测定患儿血清中特异性抗体滴度，包括90%的MP-IgM、10%的MP-IgG，滴度>1∶80为阳性，双份血清的第2份血清(恢复期)较第1份血清(急性发作期)MP-IgM和(或)MP-IgG滴度上升4倍或下降至原来的1/4(相隔2周)，为支原体急性感染。RMPP诊断标准:MPP经大环内酯类抗菌药物正规治疗≥7d，临床症状仍继续加重，伴有发热、肺部影像学体征。排除标准:(1)先天性心脏病、遗传代谢性疾病、神经系统疾病、支气管肺发育不良和免疫缺陷;(2)合并其他病原体感染。收集MPP患儿的一般临床资料，包括发病年龄、性别、症状(鼻塞、咳嗽、发热、喘息、喂养困难)、肺部体征(肺实变、胸腔积液等)、入院前抗生素使用情况及淋巴细胞绝对计数、C反应蛋白(CRP)及降钙素原(PCT)等生化指标。另选同期体检健康儿童106例(NC组)作为对照组。

1.2T淋巴细胞亚群检测

每50μL肝素抗凝静脉血中加入相应淋巴细胞亚群的荧光抗体各10μL，混匀后在暗室下孵育，然后加入稀释的溶血素裂解红细胞，混匀后再次暗室下孵育，离心、洗涤后采用流式细胞仪对外周血淋巴细胞亚群进行检测，记录T淋巴细胞表达CD3+、CD3+CD4+、CD3-CD8+、CD4+/CD8+、CD3-CD19+、CD19+CD23+及CD3-CD(16+56+)的水平。

1.3淋巴细胞绝对计数、CRP、PCT及HMGB1水平检测

入院时采集患儿外周血进行血常规检测，记录淋巴细胞绝对计数。外周血离心后取上清液，应用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测CRP、PCT及HMGB1水平，操作步骤参照试剂盒说明书进行。对于HMGB1水平的检测，还应用荧光定量PCR检测22例RMPP、32例NRMPP及22例体检健康儿童:分离外周血单核细胞，用Trizol进行裂解，提取RNA，用逆转录酶转录成cDNA，配好体系上机进行反应，采用基因表达阈值(Ct)的方法计算，每个样本重复检测3次。

1.4统计学方法

应用SPSS22.0软件，计数资料采用χ2检验或Fisher确切概率法，正态分布的计量资料以表示，采用t检验或方差分析，非正态分布的计量资料以M(P25,P75)表示，采用秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1两组患儿一般资料比较

两组患儿的性别、鼻塞、喂养困难、入院前抗生素使用比例比较差异无统计学意义(P>0.05)。RMPP组患儿的发病年龄、咳嗽比例、肺部体征比例、发热时间、住院时间均大于或长于NRMPP组，而喘息比例小于NRMPP组(P均<0.01)。见表1。

表1两组患儿一般资料比较

2.2三组儿童实验室指标比较

与NRMPP组和NC组比较，RMPP组患儿的CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+、CD3-CD19+、CD19+CD23+、CD3-CD(16+56+)水平均下降，外周血淋巴细胞绝对计数、HMGB1、CRP及PCT水平均升高(P均<0.05);荧光定量PCR检测结果显示，RMPP组的HMGB1-mRNA水平高于NRMPP组和NC组。见表2。

表2三组儿童实验室指标比较

2.3利用ROC评估RMPP的预测指标

ROC分析显示，CD3+CD4+、CD19+CD23+、HMGB1、CRP及PCT水平可预测RMPP，其AUC(95%CI)分别为0.887(0.857,0.917)、0.827(0.788,0.865)、0.907(0.863,0.951)、0.844(0.789,0.898)、0.788(0.727,0.849)，敏感性分别为87%、82%、89%、85%、79%，特异性分别为78%、74%、81%、76%、72%，诊断界值分别为1.31×109/L、0.38×109/L、7.82μg/L、0.36mg/L、30.78mg/L。见图1。

图1ROC评估RMPP的预测指标

3、讨论

MP感染可引起上下呼吸道感染，虽然大多数可以康复，但是近年来由于大环内酯类药物的滥用和耐药菌株的出现，RMPP的发生率迅速上升[8,9]。因此，尽早识别并及时治疗RMPP非常重要。RMPP患儿发病年龄较大、症状体征(咳嗽、发热、肺部体征)明显、住院时间更长[5]，考虑原因为年龄较大的患儿免疫反应体系成熟，MP感染后引发了强烈的免疫应答反应。由于RMPP患儿更易引起免疫炎症反应，咳嗽、发热等应激反应更明显，导致呼吸道上皮细胞损伤、纤毛活动迟缓、细胞溶解性坏死，引起肺部体征，加重机体炎症反应。若诊治不及时或不规范，可导致病原体产生更高耐药性，促使RMPP患儿病情进展，最终导致住院时间延长。

MPP感染可破坏机体正常的T淋巴细胞亚群平衡，导致免疫系统发生紊乱。T淋巴细胞主要通过释放的细胞因子参与机体识别抗原发生细胞免疫应答。根据T淋巴细胞表面抗原分为CD4+辅助性T细胞和CD8+辅助性T细胞，而CD3+是成熟辅助性T细胞的表面标志，CD3+CD4+辅助性T淋巴细胞能促进细胞毒性T淋巴细胞(CD8+)、B细胞等免疫细胞的增殖及分化，参与细胞免疫和体液免疫反应，毒性T淋巴细胞(CD8+)的激活主要抑制机体的免疫反应。李娜等[5]研究58例RMPP患儿和166例NRMPP患儿发现，CD3+、CD4+、CD19+的绝对数明显下降，提示T细胞的免疫和活化功能受到抑制。亦有研究[10]发现，MPP患儿可引起Th1/Th2细胞比例失衡，造成Th2细胞因子增多，刺激一系列炎性因子如转化生长因子(TGF-β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)等细胞因子释放，参与炎症介质等反应介导免疫应答。本研究表明，RMPP患儿的CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+、CD3-CD19+、CD19+CD23+及CD3-CD(16+56+)的细胞绝对计数明显低于NRMPP患儿和健康儿童，提示免疫功能紊乱参与了RMPP患儿的发病机制，导致病情的迁延变化。

淋巴细胞绝对计数、CRP及PCT水平也是反映MPP机体免疫及炎性反应的敏感指标[5,11,12,13]。本研究发现，与NRMPP组和NC组比较，RMPP组患儿淋巴细胞绝对计数明显下降，而CRP及PCT水平明显升高，提示RMPP患儿的局部机体炎症反应更严重[5,11,12,13]，这些指标可作为判断MPP病情严重程度的预测指标。HMGB1是一种高度保守核蛋白，在生物体中分布广泛，含量丰富，其在炎症反应过程中发挥着重要作用[5]。HMGB1参与炎症性疾病的发病机制，并广泛介导炎症免疫反应，从炎症反应和灭活细菌到组织的修复[5,14]。HMGB1在感染期间启动并维持免疫反应，当细胞坏死时，核内的HMGBl释放到胞外，引起巨噬细胞等分泌促炎性介质，可促进早期释放炎性因子(TNF-α和IL-6)，下游的炎性反应增强，促使炎性反应迁延不愈[15]。国外的一项研究[16]表明，呼吸道合胞病毒(RSV)感染气道上皮细胞可诱导HMGB1的大量释放，HMGB1随后通过激活原代单核细胞触发免疫反应。目前，关于HMGB1在RMPP患儿中表达的报道较少。本研究发现，RMPP患儿的HMGB1水平高于NRMPP患儿，可见HMGB1对RMPP和NRMPP具有较好的鉴别诊断能力。

本研究还对各项差异性指标进行了ROC特异性分析，发现CD3+CD4+、CD19+CD23+、HGBM1、CRP及PCT水平对RMPP患儿具有特异性预测价值，但HGBM1比CRP、PCT更具有鉴别诊断价值，其AUC最大，表明这些免疫炎症反应指标对鉴别RMPP患儿具有较好的临床应用价值。

综上所述，RMPP患儿T淋巴细胞亚群水平降低(尤其是CD3+CD4+、CD19+CD23+)，外周血HMGB1及CRP、PCT等生化指标水平升高，这些指标参与了RMPP患儿发病的免疫炎症反应机制，同时也是鉴别诊断RMPP与NRMPP的良好生物标志物，可为早期干预治疗提供一定帮助。

参考文献：

[4]赵艳飞.布地奈德雾化吸入佐治儿童支原体肺炎的疗效及其对血清IgE､IL-3､IL-4水平的影响[J].儿科药学杂志,2013,19(5):27-29.

[5]李娜,穆亚平,陈静,等.淋巴细胞亚群绝对计数对儿童难治性肺炎支原体肺炎的早期预测作用[J].中国当代儿科杂志,2019,21(6):511-516.

[7]中华医学会儿科学分会呼吸学组.儿童社区获得性肺炎管理指南(试行)(下)[J].中华儿科杂志,2013,51(11):856-862.

[10]丁林,季伟,孙慧明,等.T淋巴细胞亚群及过敏原与婴幼儿肺炎支原体感染伴喘息的关系[J].中国当代儿科杂志,2016,18(12):1254-1258.

张芳芳,张小玲,刘艳.难治性肺炎支原体肺炎患儿T淋巴细胞亚群和高迁移率族蛋白B1的表达水平及临床意义[J].儿科药学杂志,2020,26(08):6-9.