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呼吸道感染患儿不可分型流感嗜血杆菌的分离率和耐药性

2020-07-30 242 上传者：管理员

摘要：目的:探讨呼吸道感染患儿不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)的分离率和耐药性。方法:收集2016年1月至2018年12月我院儿科门诊和住院部收治的7843例呼吸道感染患儿的痰液标本，分别进行细菌分离和鉴定、血清学分型、药敏试验及β-内酰胺酶表型检测，统计NTHi的分离率、β-内酰胺酶表型、耐药率和3年变迁情况。结果:共分离出927株流感嗜血杆菌(Hi)，总分离率11.82%，其中NTHi为280株，占Hi株数的30.20%，占总标本数的3.57%。NTHi在Hi中和总体标本中的分离率呈逐年上升趋势(P<0.01),NTHi在Hi中和总体标本中的分离率随年龄增长呈下降趋势(P<0.01)。NTHi对氨苄西林和复方磺胺甲唑耐药率较高，分别为29.64%和43.57%，对阿奇霉素和亚胺培南的耐药率较低，分别为0.36%和0.71%。NTHi对氨苄西林和复方磺胺甲唑的耐药率均呈逐年上升趋势(P<0.05)，对其余抗菌药物耐药率随时间变化有所上升，但未呈逐年上升趋势(P>0.05)。280株NTHi中β-内酰胺酶阳性菌株检出率为30.71%，呈逐年上升趋势(P<0.05),NTHi中β-内酰胺酶阳性菌株对氨苄西林、头孢呋辛、亚胺培南和复方磺胺甲唑的耐药率高于β-内酰胺酶阴性菌株(P均<0.05)。结论:NTHi的分离率和β-内酰胺酶阳性菌株检出率均呈逐年上升趋势。大环内酯类药物阿奇霉素及第二代和第三代头孢菌素具有相对较低的耐药率，不良反应在可接受范围内，可作为NTHi感染的首选用药。

关键词：
β-内酰胺酶
不可分型
呼吸道感染
患儿
流感嗜血杆菌
耐药性
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流感嗜血杆菌是社区获得性肺炎常见的条件致病菌之一，大多定植于人体上呼吸道黏膜。Hi通常可分为a型、b型、c型、d型、e型和f型菌株6种，其中b型流感嗜血杆菌(Hib)是导致儿童发生严重细菌感染的主要菌株[1]。随着抗菌药物的普遍应用和Hib疫苗的不断普及，近20年来，Hib感染率在全球范围内显著下降，国内外学者对该类型菌株的关注度随之减弱。但越来越多的临床研究发现，不可分型流感嗜血杆菌可能正逐渐取代Hib，成为导致儿童发生严重细菌感染的主要致病菌[2]，但迄今为止NTHi的相关研究较为匮乏。因此，本研究对近年来我院收治的呼吸道感染患儿NTHi分离率、β-内酰胺酶表型和耐药性的变迁情况进行统计分析，旨在为本地儿童呼吸道感染的诊治和预防提供流行病学依据。

1、资料和方法

1.1菌株来源

收集2016年1月至2018年12月我院儿科门诊和住院部收治的7843例呼吸道感染患儿的合格痰液标本，其中男3783例，女4060例，年龄0～14(4.45±1.04)岁，临床诊断包括急性扁桃体炎、急性支气管炎、肺炎、急性鼻窦炎等。

1.2方法

1.2.1标本采集

所有患儿均于入院当日或次日取咽喉深部痰液，进行痰液涂片，低倍镜下观察到每视野上皮细胞<10个、白细胞>25个，则可判断为合格痰液标本。操作流程均按《全国临床检验操作规程》(第4版)[3]进行。

1.2.2细菌分离和鉴定

将标本接种于哥伦比亚血平板(法国生物梅里埃公司)和巧克力嗜血杆菌平板(法国生物梅里埃公司)，置于CO2培养箱孵育18～24h。孵育完成后将无色透明、似露滴状的微小菌落作为可似菌落，经革兰染色显示为阴性短小杆菌者在血琼脂平板(法国生物梅里埃公司)上进行卫星试验，结果为阳性者进一步行X、V、X+V因子需求试验(丹麦ROSCO公司)，X+V因子为阳性者则可鉴定为Hi。

1.2.3血清学分型

对分离获得的Hi采用玻片凝集法进行血清学分型，各分型的Hi荚膜型特异性抗血清由日本生研株式会社生产，1min内若出现肉眼可见凝集，可判断为对应的血清分型，若均不凝集，则为NTHi。

1.2.4药敏试验

采用纸片扩散法(法国生物梅里埃公司)进行药敏试验，以流感嗜血杆菌ATCC49247为质控菌株(上海北诺生物科技有限公司)，对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸钾、头孢呋辛等12种常用抗菌药物进行药敏试验。参照美国临床和实验室标准协会(CLSI)M100S27标准进行判断。

1.2.5β-内酰胺酶表型检测

采用头孢硝噻吩显色法，使用无菌去离子水将头孢硝噻吩纸片(法国生物梅里埃公司)湿润后，蘸取Hi菌落，10min内观察结果，若纸片变为红色则判断为β-内酰胺酶阳性，若1h仍未观察到颜色变化则判断为β-内酰胺酶阴性。阳性对照采用金黄色葡萄球菌ATCC29213，阴性对照采用金黄色葡萄球菌ATCC25923。

1.3观察指标

将7843例标本按年龄分为0～3岁、4～6岁和7～14岁三个组，统计NTHi的分离率，统计分离出的NTHi对12种常用抗菌药物的耐药率和3年变迁情况，统计分离出的NTHi菌株β-内酰胺酶的表型和3年变迁情况，β-内酰胺酶阳性和阴性菌株对12种常用抗菌药物的耐药率。

1.4统计学方法

应用SPSS软件中线性关联法对Hi分离率、NTHi分离率、耐药率等进行趋势检验，β-内酰胺酶阳性和阴性菌株对12种常用抗菌药物的耐药率比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1NTHi的分离率和3年变迁情况

2016年1月至2018年12月共分离出927株Hi(剔除同一患儿同次住院的重复株)，总分离率11.82%，其中NTHi为280株，占Hi株数的30.20%，占总标本数的3.57%。趋势检验显示，Hi的分离率随时间变化有所上升，但未呈逐年上升趋势(χ2=1.070,P>0.05),NTHi在Hi中和总体标本中的分离率呈逐年上升趋势(χ2分别为12.090和12.267,P<0.01)。见表1。

表1NTHi分离率和变迁情况

2.2不同年龄组NTHi的分离率比较

趋势检验显示，Hi分离率随年龄增长呈下降趋势(χ2=7.637,P<0.01),NTHi在Hi中和总体标本中的分离率亦随年龄增长呈下降趋势(χ2分别为3.174和29.194,P均<0.01)，见表2。

表2不同年龄组NTHi的分离率比较

2.3NTHi对常用抗菌药物的耐药性变迁情况

NTHi对氨苄西林和复方磺胺甲唑的耐药率较高，分别为29.64%和43.57%，对阿奇霉素和亚胺培南的耐药率较低，分别为0.36%和0.71%。趋势检验显示，NTHi对氨苄西林和复方磺胺甲唑的耐药率均呈逐年上升的趋势(χ2分别为5.880和0.479,P均<0.05)，对其余抗菌药物的耐药率随着时间变化有所上升，但未呈逐年上升趋势(P均>0.05)。见表3。

表3NTHi对常用抗菌药物的耐药性变迁情况

2.4NTHi中β-内酰胺酶表型结果的变迁情况

280株NTHi中β-内酰胺酶阳性菌株检出率为30.71%，检出率呈逐年上升趋势(P<0.05)，见表4。

表4NTHi中β-内酰胺酶表型结果的变迁情况

2.5NTHi中β-内酰胺酶阳性和阴性菌株对抗菌药物的耐药率

NTHi中β-内酰胺酶阳性菌株对氨苄西林、头孢呋辛、亚胺培南和复方磺胺甲唑的耐药率高于β-内酰胺酶阴性菌株，差异有统计学意义(P均<0.05)，见表5。

表5NTHi中β-内酰胺酶阳性和阴性菌株对抗菌药物的耐药率

3、讨论

3.1Hi血清分型变迁

由于诊断困难、患儿年龄较小及耐受力差、耐药菌株增多等因素，Hib感染的治疗效果受到一定限制，多数国家已将Hib疫苗纳入国家常规计划免疫。调查[4]显示，5岁以下儿童侵袭性Hib年发病率大幅度下降，因此，接种疫苗成为预防Hib感染最重要且有效的手段。在我国，该疫苗仍未纳入国家常规计划免疫，一项Meta分析[5]结果显示，我国儿童Hib疫苗接种率合并值为55.90%，且东部高于西部，城市高于农村，本地人口高于流动人口，说明该疫苗在我国的接种率偏低，存在地区差异。尽管如此，该疫苗仍对Hi各血清分型的构成造成了一定影响，Hib型检出率下降，其他类型上升，还有一种类型的Hi因无荚膜而无法进行血清学分型，因此命名为NTHi。有研究[6]发现，NTHi在家庭成员之间的传染性极强，且侵袭性和致病性均较强，给儿童带来的伤害在一定程度上大于Hib，还有研究[7]提示NTHi在国外曾引起院内的暴发感染。因此，国内外学者近年来将Hi的研究重点转向NTHi。

3.2NTHi的分离率变迁

本研究结果显示，2016-2018年我院儿科Hi的总分离率为11.82%，其中NTHi为280株，占Hi株数的30.20%，占总标本数的3.57%，进一步行趋势检验发现，NTHi在Hi中和总体标本中的分离率呈逐年上升趋势，略高于刘东华等[8]研究中的26.80%NTHi分离率，但分离率均逐年上升，提示对NTHi的诊断和预防是减少儿童呼吸道感染的重点。本研究结果与胡莹等[9]研究中NTHi占94.51%的结果存在较大差异，可能与研究对象年龄、疾病类型和地区差异有关，也同样说明Hi流行病学特征已发生了重要变迁，为临床防治儿童呼吸道感染提供了重要的流行病学依据。对不同年龄段的分离率进行比较，发现Hi分离率随年龄增长呈上升趋势，NTHi在Hi中和总体标本中的分离率亦随年龄增长呈上升趋势，说明与Hib感染类似，0～3岁仍然是NTHi感染的高发年龄段，与婴幼儿呼吸系统发育不完善、免疫功能低下密切相关，因此对于年龄较小的儿童同样应当重视NTHi感染的可能性。

3.3NTHi对抗菌药物的耐药率变迁

无论何种类型的Hi感染，抗菌药物的应用均是治疗的主要手段，但随着抗菌药物的不合理应用，细菌对其耐药率不断上升，耐药谱也发生了不同程度的变迁。本研究中，NTHi对氨苄西林和复方磺胺甲唑的耐药率较高，分别为29.64%和43.57%，对阿奇霉素和亚胺培南的耐药率较低，分别为0.36%和0.71%。趋势检验显示，NTHi对氨苄西林和复方磺胺甲唑的耐药率均呈逐年上升趋势，对其余抗菌药物的耐药率随时间变化有所上升，但未呈逐年上升趋势，与刘东华等[8]和陈韧刚[10]的研究结果相似，说明随着氨苄西林和复方磺胺甲唑的广泛应用，NTHi已对其产生了较强的耐药性，但对其他抗菌药物依然保持相对较高的敏感性。需要注意的是，由于临床抗菌药物的不合理应用，一些多重耐药株开始出现，但本研究未对NTHi的多重耐药株进行分析，未能获得相关流行病学资料。

3.4β-内酰胺酶表型结果的变迁

若菌株β-内酰胺酶阳性，可预示该菌株对氨苄西林存在耐药性，而对氨苄西林和阿莫西林的敏感性较为一致，因此对β-内酰胺酶表型的检测可实现菌株对这两种抗菌药物敏感性的快速预测。本研究中，280株NTHi中β-内酰胺酶阳性菌株检出率为30.71%，检出率呈逐年上升趋势，与NTHi对氨苄西林耐药率呈逐年上升趋势的研究结果一致，且NTHi中β-内酰胺酶阳性菌株对氨苄西林、头孢呋辛、亚胺培南和复方磺胺甲唑的耐药率均高于β-内酰胺酶阴性菌株，证实了NTHi对氨苄西林耐药的机制主要是由于产生了β-内酰胺酶。编码β-内酰胺酶的基因仅小部分存在于染色体DNA上，大部分存在于质粒DNA上，质粒所介导的耐药基因包括TEM型和ROB型。有研究[11,12]提示耐氨苄西林Hi产β-内酰胺酶的基因型均为TEM型，但本研究未对分离的NTHi菌株进行β-内酰胺酶基因检测，因此无法确定我院儿科NTHi产β-内酰胺酶的基因分型，在今后的研究中可进一步探讨。此外，β-内酰胺酶阴性菌株氨苄西林耐药的机制主要为细菌的细胞壁上青霉素结合蛋白3的ftsl基因氨基酸位点置换使空间构象发生改变，从而影响细菌与β-内酰胺类抗菌药物的亲和力[13]。本研究结果显示，NTHi中β-内酰胺酶阴性菌株对氨苄西林耐药的检出率仅为1.03%，与秦惠宏等[14]和陈伟等[15]的研究结果Hi中11.10%和11.80%的β-内酰胺酶阴性菌株氨苄西林耐药率存在一定差异，可能与研究对象年龄、疾病和地区分布差异有关，也可能与NTHi分型的特殊性有关，有待进一步的验证。

综上所述，在儿童呼吸道感染中，NTHi的分离率和β-内酰胺酶阳性菌株检出率呈逐年上升的趋势，说明NTHi感染的比例及其对抗菌药物的耐药性逐渐上升，临床需加以重视，尤其是对于年龄较小的儿童，应及时进行痰液检测和对症治疗。在抗菌药物选择方面，由于NTHi对氨苄西林和复方磺胺甲唑的高耐药率，不宜推荐作为首选治疗药物;左氧氟沙星和环丙沙星耐药率相对较低，但其不良反应可能给儿童生长发育带来影响，目前亦不建议用于儿童;亚胺培南为碳青霉烯类抗生素的代表，主要应用于严重感染，不可作为普通感染的首选用药;大环内酯类药物阿奇霉素及第二代和第三代头孢菌素则具有相对较低的耐药率，且不良反应在可接受范围内，可作为NTHi感染的首选用药。

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