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大蒜素通过HBV启动子SP2抑制HBV复制

2025-03-27 96 上传者：管理员

摘要：目的探究大蒜素(allicin)对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响并初步阐明其调控分子机制｡方法不同浓度的大蒜素处理HepG2.2.15细胞,采用ELISA检测HBsAg和HBeAg的表达水平,CCK-8实验评估大蒜素对细胞活力的影响,从中筛选出适宜的药物浓度;以该浓度的大蒜素处理HepG2-NTCP细胞,48 h后通过RT-qPCR检测HBV相关标志物的表达;通过双荧光素酶报告基因实验,分析4种HBV启动子(EnhⅠ/Xp, SP1, SP2和CP)的活性,并评估大蒜素对这些启动子活性的影响;使用工具Gene-regulation预测可能与启动子结合的转录因子,过表达转录因子后处理细胞以检测大蒜素对启动子活性的影响｡最后,通过ChIP实验验证转录因子与HBV启动子的结合情况,以及大蒜素处理是否改变这种结合｡结果大蒜素呈浓度依赖性显著降低HBsAg表达水平,同时对HBeAg表达有轻微抑制作用(P<0.001);40μmol/L的大蒜素表现出最佳的抗病毒效果,且对细胞活力无显著影响;此外,40μmol/L的大蒜素还能显著抑制HBV的DNA复制和转录水平(P<0.05);大蒜素显著抑制了HBV启动子SP2的活性(P<0.001);进一步研究发现,转录因子SP1能够与HBV启动子SP2的DNA序列结合,经大蒜素处理后,该结合显著受到抑制(P<0.001)｡结论大蒜素通过抑制转录因子SP1与HBV启动子SP2的结合,降低HBV的转录水平,进而抑制病毒的复制｡

关键词：
HBV启动子SP2
乙型肝炎病毒
大蒜素
抗病毒
转录调控
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乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是全球主要的公共卫生问题之一,可引起肝脏纤维化､肝硬化等严重病变[1]｡2019年全球约有2. 96亿人患有慢性乙型肝炎,每年新增约150万例感染者,导致约82万人因HBV引起的肝硬化和肝细胞癌死亡[2]｡大蒜含有一种主要的生物活性成分———大蒜素(alli⁃cin),具有抗菌､抗氧化､抗炎等多重作用[3⁃4]｡研究表明,大蒜素不仅能够增强免疫功能[5],还展现出抗病毒的潜力,特别是在抑制SARS⁃CoV⁃2病毒复制方面,是一种有前景的抗病毒天然化合物[6]｡转录因子SP1(transcription specificity protein 1,SP1)是一种广泛存在于多种细胞中的转录因子,能够与DNA上的特定序列结合,调控基因的转录｡SP1通过调节与免疫反应､病毒复制和病毒基因表达相关的基因,在某些病毒(如乙型肝炎病毒和HIV)的复制过程中起促进作用[7]｡有研究表明,SP1的结合位点存在于HBV基因组中的ENII增强子､核心启动子和S启动子等多个位置,作为转录因子,它能够结合到这些启动子上并调控HBV的活性[8]｡本研究旨在探讨大蒜素对HBV复制的影响及其调控机制｡结果表明,大蒜素通过抑制SP1与启动子SP2结合,从而减少HBV启动子SP2的活性｡这些发现为大蒜素抗HBV的分子机制提供了初步证据,并为开发新的抗HBV治疗策略提供理论支持｡

1、材料与方法

1. 1材料

1. 1. 1细胞系与质粒载体:

经过HBV基因修饰的HepG2衍生细胞系HepG2 2. 2. 15,具有稳定的病毒复制能力并能持续分泌抗原(中国典型培养物保藏中心) ;通过引入NTCP受体优化构建的HepG2⁃NTCP细胞系,具备高效模拟HBV感染的核心特性,由北京生命科学研究所李文辉教授实验室惠赠; SP1过表达质粒载体为p3 ×⁃FLAG⁃CMV⁃14真核表达载体;HBV启动子( EnhⅠ/ Xp,SP1､SP2和CP)质粒的骨架载体为pGL3⁃Basic,均由上海捷瑞生物工程有限公司构建; 1. 3×HBV基因型B分离株S64装载至pUC18载体(称为1. 3×HBV质粒)由李文辉教授实验室提供,其中“1. 3 × ”表示该质粒包含完整的HBV基因组(1倍)以及额外的0. 3倍重复序列设计,确保病毒在宿主细胞中的高效复制和表达｡

1. 1. 2主要试剂:

MEM培养基､胎牛血清( FBS)､非必需氨基酸(NEAA) (Gibco公司);大蒜素(MCE公司);Lipofectamine 3000转染试剂盒(Invitrogen公司);双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega公司);超纯RNA提取试剂盒,RIPA裂解缓冲液(北京康为世纪生物科技有限公司);反转录试剂盒(东洋纺生物科技有限公司);RT⁃qPCR引物(天一辉远生物科技有限公司);抗SP1抗体(武汉三鹰生物技术有限公司);ELISA试剂盒(万泰生物);DNA纯化试剂盒(碧云天公司);CCK⁃8试剂(Apexbio公司)｡

1. 2方法

1. 2. 1细胞的培养与大蒜素处理:

细胞培养使用含10% FBS的MEM培养基+1% NEAA,在37℃ ､5%CO2的培养箱中培养｡取对数增殖期的细胞接种至24孔板,待细胞汇合度达到70%时进行大蒜素处理,处理48 h后进行后续实验｡

1. 2. 2酶联免疫吸附试验(ELISA):

使用ELISA试剂盒定量检测HepG2⁃NTCP､HepG2. 2. 15细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg浓度｡通过酶标仪(BioTek)在450 nm处测定吸光度｡

1. 2. 3染色质免疫沉淀(ChIP)实验:

HepG2. 2. 15细胞转染1. 3×HBV,6 h后处理组加大蒜素处理,48 h后使用1%甲醛固定细胞,交联DNA⁃蛋白质复合物｡固定后的细胞被裂解,并通过超声破碎剪切染色质｡离心去除不可溶物后,溶解的染色质取一部分作为Input组,剩下的平均分为两组分别与特异性抗体( SP1或IgG)共同孵育过夜｡然后,使用Protein A/ G Plus琼脂糖珠在4℃下孵育2 h捕获复合物｡经过充分洗涤后,将沉淀的染色质从珠上洗脱,并通过65℃ 加热4 h逆转交联｡随后,使用DNA纯化试剂盒纯化DNA,作为PCR扩增模板,并进行凝胶电泳分析｡

1. 2. 4双荧光素酶报告基因实验( dual⁃luciferasereporter gene experiment):

细胞接种于24孔板中,培养12 h后,加入40 μmol / L的大蒜素至培养基中｡经过4 h处理后,细胞被瞬时转染含有荧光素酶报告基因的质粒( HBV启动子EnhⅠ/ Xp､SP1､SP2和CP)｡孵育48 h后,收集细胞并使用PromegaGloMAX 96微孔板荧光仪测定荧光素酶活性｡

1. 2. 5细胞活力测定(CCK⁃8 assay):

HepG2. 2. 15细胞以2 × 104个/孔的浓度接种于96孔板中,8 h后,10､20､40或80 μmol / L的大蒜素处理｡处理48 h后,每孔加入10 μL CCK⁃8溶液,继续在37℃下孵育1 h｡最后,使用酶标仪在450 nm处测定吸光度｡

1. 2. 6实时荧光定量PCR( qPCR):

采用Trizol法提取细胞总RNA,按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA｡随后根据试剂盒说明进行扩增,以GAPDH作为内参检测总RNA和pg⁃RNA的相对表达｡本实验所需引物如下:GAPDH上游引物5′⁃TCTGACTTCAACAGCGACAC⁃3′,下游引物5′⁃CAAATTCGTTGTCATACCAG⁃3′; HBV total⁃RNA上游引物5′⁃TCACCAGCACCATGCAAC⁃3′,下游引物5′⁃AAGCCACCCAAGGCACAG⁃3′;HBV pg⁃RNA上游引物5′⁃GAGTGTGGATTCGCACTCC⁃3′,下游引物5′⁃GAGGCGAGGGAGTTCTTCT⁃3′｡

1. 3统计学分析

实验结果以平均值±标准差表示,使用GraphPad Prism 8. 0软件进行数据分析｡两组实验数据采用独立样本t检验,多组样本间的比较采用单因素方差分析( One⁃way ANOVA)｡当P < 0. 05时,表示差异具有统计学意义｡

2、结果

2. 1大蒜素抗HBV效果验证

具有稳定病毒复制能力并能持续分泌抗原的HepG2. 2. 15细胞分别用20､40或80 μmol / L的大蒜素处理后,HBsAg和HBeAg的表达水平呈浓度依赖性下降,其中HBsAg的下降更为显著(P<0. 01) (图1A,B)｡40. 0 μmol / L的大蒜素处理对细胞活力无明显影响,同时具有较好的抗病毒效果(图1C)｡

图1不同浓度大蒜素处理HepG2. 2. 15细胞后HBV抗原表达水平和细胞活力的变化

图2大蒜素抑制HBV DNA复制和转录水平

图3大蒜素对HBV启动子SP2的启动子活性抑制

图4转录因子SP1结合HBV启动子SP2及大蒜素的调控作用

2. 2大蒜素抑制HBV DNA复制和转录水平

qPCR结果显示,大蒜素显著抑制了HBV的转录水平,HBV total⁃RNA和pg⁃RNA的表达明显下降(P<0. 05)(图2A,B)｡同时,大蒜素处理也抑制了HBV DNA复制(P<0. 05)(图2C)｡

2. 3双荧光素酶报告基因实验确定

大蒜素对HBV启动子SP2的启动子活性抑制最显著以pGL3⁃Basic质粒为对照,构建的4种HBV启动子均有活性(图3A)｡大蒜素处理后,显著抑制了HBV启动子SP2的启动子活性(P<0. 001)(图3B)｡

2. 4转录因子

SP1结合HBV启动子SP2及大蒜素的调控作用在预测DNA序列中转录因子结合位点的网站Gene⁃Regulation Alibaba2 ( http:/ / www. gene⁃regulation.com)中预测结果显示,在HBV启动子SP2序列上存在转录因子SP1结合位点(图4A)｡ChIP实验结果显示,SP1与HBV启动子SP2的结合信号明显,表明SP1可以直接与HBV启动子SP2结合｡大蒜素处理组SP1与HBV启动子结合信号较未处理组显著降低( P < 0. 001),表明大蒜素干扰了SP1与HBV启动子SP2的结合(图4B)｡

3、讨论

大蒜素是大蒜中的主要活性成分,具有多重生物学功能｡研究表明,大蒜素对乙型肝炎病毒､流感病毒B､HIV⁃1､疱疹病毒等多种病毒有显著的抑制作用,显示其作为广谱抗病毒剂的潜力[9⁃10]｡其抗病毒机制主要通过干扰病毒复制周期的关键环节,如吸附､穿入､脱壳及病毒释放等过程,还能破坏病毒颗粒结构,降低感染能力[11]｡此外,大蒜素通过调节免疫系统增强抗病毒反应,特别是促进巨噬细胞的吞噬能力,有助于清除体内病毒[12]｡大蒜素抗氧化特性还可减少病毒感染引发的氧化应激和炎症反应,保护细胞免受损害,从而提升机体抗病毒能力[13]｡然而,大蒜素在抗乙型肝炎病毒的具体机制仍需进一步研究｡

SP1作为一种关键的转录因子,通过与HBV启动子结合,显著增强了病毒的基因表达和复制效率[14]｡研究表明, SP1的功能受到多种因子的调控,如肝特异性转录因子HNF1和HBV编码的X蛋白(HBx)通过影响SP1的活性,调控HBV生命周期[15]｡此外, LncRNA HOTAIR的参与也能增强SP1的活性,进一步促进病毒转录与复制[8]｡但目前关于大蒜素与转录因子SP1之间是否存在某种关联尚不清楚｡

本研究探讨了大蒜素对乙型肝炎病毒(HBV)复制的抑制作用及其潜在分子机制,结果表明,40 μmol / L的大蒜素能够有效抑制HBV的DNA复制和转录水平,并对细胞活力无显著影响｡此外,通过双荧光素酶报告基因实验和ChIP实验,验证了大蒜素对HBV启动子SP2活性的抑制作用,并进一步确认转录因子SP1与SP2启动子的结合在大蒜素处理后显著减弱｡这些结果为进一步研究大蒜素在抗乙肝病毒治疗中的潜力提供了理论依据｡

然而,本研究存在一些局限性,未来仍需进一步探讨｡HepG2. 2. 15细胞和HepG2⁃NTCP细胞虽然支持HBV复制,但其产生的感染性病毒颗粒数量和传播能力不足以完全模拟体内感染情境｡因此,需要在人原代肝细胞( primary human hepatocyte,PHH)等更能真实模拟HBV感染环境的模型中,验证大蒜素的抗病毒效果｡

总之,本研究初步揭示了大蒜素抑制HBV复制的分子机制,为利用食品化学物质干预HBV治疗提供了新的科学依据｡

基金资助:国家重点研发计划(2021YFC2700601);

文章来源:卢莉莉,朱席琳,伍晓盼,等.大蒜素通过HBV启动子SP2抑制HBV复制[J].基础医学与临床,2025,45(04):465-470.