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探讨韩式治疗仪对大鼠孤独症模型仔鼠的作用研究

2025-01-21 67 上传者：管理员

摘要：目的：探究韩式治疗仪干预大鼠孤独症仔鼠的治疗作用。方法：通过大鼠合笼见阴栓为妊娠第1天（E1），孕鼠在E12.5 d时（孕中期），模型组孕鼠腹腔注射丙戊酸钠600 mg/kg，出生后3周开始进行韩式治疗仪干预“长强穴”和“太溪穴”韩式治疗仪治疗7 d，在干预前进行模型组与对照组的行为学观察，干预结束后，处死各组大鼠，取脑组织，进行HE染色，qPCR检测其中IL-1β、TNF-α、IL-4、p53 mRNA的表达情况。结果：行为学分析显示：模型组子代鼠发育明显落后：体质量偏低、睁眼时间延长，1个月内病死率和畸形率高于对照组，修饰行为、群集性活动少于对照组，攻击性行为增加（P<0.05）。HE染色结果显示，对照组海马细胞结构完整正常，模型组海马细胞减少，浦肯野细胞层细胞减少，部分炎症细胞浸润，治疗组海马细胞结构清晰正常，浦肯野细胞层细胞部分恢复增生，凋亡细胞减少，正常细胞增多。qPCR检测模型组大鼠脑组织IL-1β、TNF-α、IL-4、p53 mRNA表达上升，治疗组大鼠IL-1β、TNF-α、IL-4、p53 mRNA表达下降。结论：韩式治疗仪干预可能通过抑制炎症反应，对大鼠孤独症模型仔鼠具有一定的治疗作用。

关键词：
孕鼠
孤独症模型
社会交往障碍
语言发育障碍
韩式治疗仪
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孤独症谱系障碍（autism spectrum disorders，ASD）是一组以社会交往障碍、语言发育障碍、狭隘兴趣及刻板行为为主要特征的神经发育障碍性疾病。研究显示近几年ASD在全球范围内发病率均呈上升趋势[1]，多项流行病学研究显示ASD患病率约为1.85%[2]，2000～2015年美国ASD患病率从1/150上升至1/45，男性高于女性，比例约为4∶1～6∶1[1,2]，国内有研究指出我国ASD患病率约为0.7%[3,4]。普遍认为ASD发病与遗传、环境、孕期感染、自身免疫等多种因素相关[5,6]。目前尚无特效药物治疗，倡导个性化康复训练综合治疗为主，循证学证据表明早期诊断、早期干预可显著改善ASD患儿预后，提高其生活质量，让患儿尽早融入正常生活[2,3,5]。因此，积极有效的ASD早期干预方法对ASD患儿的功能改善至关重要。故明确ASD的发病机制对于该疾病的预防和治疗至关重要[3-5]。近年来中医及针灸在ASD治疗和康复方面有积极作用[7,8]，其中韩式治疗仪（HANS）是由中科院院士、北京大学神经科学研究所经过40余年研发的具有针刺镇痛机理及低频脉冲理疗仪器，作用机理可能与相关部位进行电脉冲刺激能激活机体内源性阿片系统，促使释放内源性阿片肽，改善微循环，缓解肌肉痉挛，发挥全身机能的调节作用有关[9,10]。本研究采用HANS干预大鼠孤独症仔鼠，并探讨其潜在机制，为HANS干预孤独症提高实验依据。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

SD雌性大鼠（体质量240～260 g），SD雄性大鼠（体质量300～320 g），SPF级，均购于北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK(京）2019-0008。

1.1.2主要试剂和设备

丙戊酸钠（C13245012）购于上海麦克林生化科技有限公司；购于苏州医疗用品厂有限公司；二甲苯（33535）、无水乙醇（32061）、95%乙醇（32061）购于西陇科学股份有限公司；苏木素染液（ZLI-9610）购于北京中衫金桥生物技术有限公司；Scott蓝化液（G1865）、伊红染色液（G1100）购于北京索莱宝科技有限公司；超净高级封片胶（YZB）购于珠海贝索（BASO）生物技术有限公司；Trizon Reagent（CW0580S）、超纯RNA提取试剂盒（CW0581M）购于江苏康为世纪生物科技股份有限公司；HiScriptⅡQ RT SuperMix for qPCR (+gDNAwiper)（R223-01）、ChamQ Universal SYBR qPCRMaster Mix（Q711-02）购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司；针灸针（212002）、韩式治疗仪（SDZ-II）购于苏州医疗用品厂有限公司；组织脱水机（KD-TS3S1）购于金华市科迪仪器设备有限公司；石蜡包埋机（HistoCore Arcadia）、切片机（HistoCore BIOCUT），摊片机（HI1210）购于德国Leica公司；电热恒温鼓风干燥箱（HGZF-101-1）购于上海跃进医疗器械有限公司，显微镜（CX41）购于日本OLYMPUS公司；全自动样品快速研磨仪（Tiss-12）购于上海净信实业发展有限公司；高速台式冷冻离心机（H1750R）购于湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；紫外分光光度仪（NP80，NanoPhotometer）购于德国Implen公司；电泳仪（DYY-8C）购于北京六一生物科技有限公司；普通PCR扩增仪（TC-EA）购于杭州博日科技有限公司；荧光PCR仪（CFX Connect™实时）、超高灵敏度化49Neural Injury And Functional Reconstruction, January 2025, Vol.20, No.1学发光成像系统仪（Chemi DocTM XRS+）购于伯乐生命医学产品（上海）有限公司。

1.2方法

1.2.1实验分组

18只大鼠随机分为正常对照组、模型组、治疗组，每组6只。

1.2.2大鼠孤独症模型构建

①合笼：将一只雌鼠与一只雄鼠放在同一个漏底笼里，每天检查托盘看是否有阴栓，有阴栓就代表雌鼠可能怀孕，记为妊娠第1天，直到妊娠第18天才单独放在一个笼子里，等待生产。若合笼第一次见阴栓后又见阴栓则上次没怀上，妊娠第1天则为这次见阴栓的日期。②孤独症造模：在大鼠妊娠12.5 d时，模型组和治疗组孕鼠腹腔注射丙戊酸钠水溶液6 mL/kg[11]。

1.2.3韩式治疗仪治疗

治疗组小鼠出生当日记为生后第一天，并录像进行行为学观察，观察行为学3周后进行韩式治疗仪干预。治疗穴位为长强穴和太溪穴，长强穴位于大鼠肛门与尾根之间的凹陷处，太溪穴位于内踝尖和跟腱之间的中心凹陷处，把小鼠固定在桌面后，对针和穴位处酒精消毒，进针深度为3～5 mm。韩式治疗仪的参数为：连续波，频率2 Hz，时间为20 min，1次/天，连续7 d。

1.2.4行为学观察

选择3周龄仔鼠，随机抽取模型组和对照、治疗组各6只，每晚8时进行红外摄像观察1 h，持续5 d。观察各组仔鼠修饰行为（理毛次数)、攻击活动、群集活动的行为学改变。

1.2.5 HE染色

将固定好的组织样本经75%、85%、95%Ⅰ、95%Ⅱ、100%Ⅰ、100%Ⅱ乙醇溶液脱水各60 min，放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各45 min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ透蜡各50～60 min，石蜡包埋，切片。将石蜡切片进行烤片，然后将切片放入二甲苯Ⅰ10 min、二甲苯Ⅱ10 min、无水乙醇Ⅰ3 min、无水乙醇Ⅱ3 min、95%酒精3 min、80%酒精3 min、纯水2 min。入苏木素染液染3～5 min，自来水洗，1%盐酸酒精分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。切片入伊红染液中染色3～5 min，流水冲洗。切片依次放入80%酒精、95%酒精、无水乙醇、无水乙醇Ⅱ快速脱水，超净高级封片胶封片。显微镜镜检，图像采集。

1.2.6荧光定量

PCR（qPCR）各组进行RNA的提取大脑海马区），提取RNA后根据逆转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板，在荧光定量PCR仪上进行检测。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法进行相对定量分析，算出各组的相对表达量，引物由通用生物系统（安徽）有限公司合成，见表1。

1.3统计学处理

所有实验重复3次，采用SPSS 26.0进行数据统计，定量结果以（均数±标准差）表示，两组之间比较采用独立样本t检验，多组之间定量数值比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05，统计图使用GraphPad Prism9绘制。

2、结果

2.1行为学分析

模型组子代鼠发育明显落后，表现为体质量偏低、睁眼时间延长，1个月内病死率和畸形率高于对照组，修饰行为、群集性活动少于对照组，攻击性行为增加；治疗组修饰行为高于模型组，攻击行为低于模型组，治疗组群集活动持续时间长、次数多于模型组，见表2。

2.2大鼠脑组织

HE染色结果正常对照组海马细胞结构完整正常，浦肯野细胞层主要由单层大梨形细胞组成，细胞浆嗜酸性，胞核呈泡状，浦肯野细胞结构正常；模型组海马细胞减少，浦肯野细胞层细胞减少，部分炎症细胞浸润；治疗组海马细胞结构清晰正常，浦肯野细胞层细胞部分恢复增生，凋亡细胞减少，正常细胞增多，见图1。

2.3大鼠脑组织

qPCR检测结果与对照组比较，模型组脑组织IL-1β、TNF-a、IL-4、p53表达上升，差异有统计学意义（P＜0.05），治疗组IL-1β、p53上升，TNF-α下降，差异有统计学意义（P＜0.05），IL-4下降，差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，治疗组脑组织IL-1β、TNF-α、IL-4、p53表达下降，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图1各组大鼠脑组织HE染色

图2各组大鼠脑组织qPCR检测

3、讨论

近年来中医针灸及理疗在ASD诊疗和康复中应用广泛，报道有运用靳三针改善局部血运，在ASD患者知觉、口语、精细动作等方面取得良好疗效[12]。采用林氏头针，在改善ASD患者的行为异常和社交能力方面有明显疗效[13,14]。物理治疗方面，中低频率脉冲电刺激和经颅磁刺激在ASD诊疗和康复中也广泛应引物名称GAPDH FGAPDH RIL-1βFIL-1βRTNF-αFTNF-αRIL-4 FIL-4 RP53 FP53 R引物序列（5’-3’）

表1各引物设计50神经损伤与功能重建

本研究结果显示ANS的作用机制可能为当给予体表电刺激时，不同参数的穴位电刺激可促使中枢神经系统释放不同的内源性阿片肽。低频（2 Hz）电刺激促使内啡肽和脑啡肽释放增加，而高频（100 Hz）电刺激可促使强啡肽释放，当上述两种频率交替刺激时，3种阿片肽同时释放。HANS对针刺镇痛机理及低频脉冲刺激参数，依据神经化学学说、闸门控制学说、经络学说、针灸技术，对相关部位进行电脉冲刺激能激活机体内源性阿片系统，促使释放内源性阿片肽，缓解疼痛，改善微循环，缓解肌肉痉挛，发挥全身机能的调节作用[17]，其机制可能与调剂PGC-1α及下游线粒体相关基因表达[7]、调节谷氨酸及N-甲基-D-天门冬氨酸受体表达有关[9,17-19]。本研究选择长强穴作为治疗主要穴位，长强穴沿督脉循行与肾、脑相交，总督诸阳，在气血津液绵绵不息的运行过程中，督脉作为重要的桥梁，沟通肾与脑，充盈髓海，运行全身气血，调节身体运动机能。通过查阅古籍，笔者发现长强穴经由督脉，与脑、肾、肝相互关系密切，互相影响，互相作用。太溪穴位于脚背部，第二、第三跖骨头后缘的凹陷中，脚趾屈时显露。太溪穴主要与肾脏功能相关，据中医理论，肾主藏精，主骨，主生殖，开窍于二阴，因此太溪穴常用于补肾益精、消肿利尿等功效，对于肾精亏虚、精气不足等症状有一定的改善作用，因此通过针刺长强穴和太溪穴，既可起到填精益髓，醒脑开窍的目的，又可通过气血的生发，带动督脉的阳气，以司主一身之阳之职。小儿本是稚阴稚阳之体，推动长强一处的阳气即可激发全身的阳气生发和运行，进而整体的调整一身阴阳，以达平衡，本研究结果显示HANS干预ASD大鼠后能有效改善IL-1β、TNF-α、IL-4、p53mRNA表达，与多项研究证明针刺长强穴能有效改善ASD，调节多种IL-1β、TNF-α等多种炎症因子释放有关[20,21]。ASD发病与神经免疫及中枢神经系统慢性炎症存在密切关联[21,22]，其中P53信号通路激活，中枢神经系统多种炎症因子IL-1β、TNF-a、IL-4等表达与ASD发病正相关[23,24]。本研究发现与对照组比较，模型组子代鼠发育明显落后，正常对照组海马细胞结构完整正常。模型组海马细胞减少，浦肯野细胞层细胞减少，部分炎症细胞浸润[24,25]。而韩式治疗仪治疗组海马细胞结构清晰正常，浦肯野细胞层细胞部分恢复增生，凋亡细胞减少，正常细胞增多。ASD模型组IL-1β、TNF-a、IL-4、p53 mRNA明显升高，而韩式治疗仪干预后IL-1β、TNF-a、IL-4、p53 mRNA水平明显下降，这表明，炎症相关因子损害可能是ASD潜在发病机制和治疗靶点。虽然我国在ASD诊治方面取得了巨大进步，尤其是在发达地区，已基本建成儿童孤独症早期筛查、诊断、干预，及社会救助体系，但由于经济发展的不均衡，我国中西部地区对孤独症群体缺乏系统性、全龄段、深层次的救治是我们当前亟待解决的难点和热点问题[26]。韩式治疗仪对ASD的治疗作用在临床显现，而运用其进行基础实验的研究项目较少，本项目运用韩式治疗仪干预孤独症模型，并通过检测相关指标得出韩式治疗可通过抑制炎症因子改善ASD的临床疗效，而具体的信号通路在本实验中尚未查明，运用本实验结果，可扩展到临床，为ASD患者提供一种新的治疗手段。【利益冲突】所有作者声明无利益冲突。

参考文献:

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基金资助:国家自然科学基金(牛磺酸通过调节NGF-Akt/Bad信号通路对大鼠孕期砷暴露诱导子代孤独症样行为的作用研究,No.82360279);贵州省省自然科学基金基础研究计划(钩藤碱对DAT基因敲除ADHD模型小鼠多巴胺D1/D2受体靶向性研究,黔科合基础-ZK-[2024]一般478);贵州省卫生健康委科学技术基金资助项目(基于IGF-1/P13K/Akt/mTOR信号通路探讨韩式治疗仪对孤独症大鼠模型的实验研究,No.gzwjk2019-1-004);

文章来源:江露,胡永胜,王耀洲,等.探讨韩式治疗仪对大鼠孤独症模型仔鼠的作用研究[J].神经损伤与功能重建,2025,20(01):49-52.