前交叉韧带是膝关节的重要稳定装置，前交叉韧带损伤后会导致膝关节严重不稳，进而引起膝关节退变[1,2]。前交叉韧带重建是当前治疗前交叉韧带损伤的“金标准”，虽然取得了较为满意的疗效，但仍有一些问题仍未解决。近年研究表明，与普通人群相比，前交叉韧带重建患者骨性关节炎发病率高并且发病年龄明显提前[3,4]，多数学者认为此现象与重建前交叉韧带后膝关节的稳定性未能完全恢复正常，下肢的生物力学仍存在异常有关[5,6]。

保留残端重建前交叉韧带是目前运动医学研究的热点，一些学者认为保留残端重建前交叉韧带能够加快移植腱血管化、促进膝关节本体感觉恢复[7,8]。自从ADACHI首先提出了保留残端重建前交叉韧带后，不少保留残端的技术被相继报道，其中临床中最常用的是“残端鞘内重建术”和“牵张保残重建术”[9,10]。然而保留残端重建前交叉韧带与传统手术比较能否取得更好的关节稳定性，进而减轻膝关节软骨的退变和凋亡，目前没有相关报道。

为了全面比较保留残端重建前交叉韧带与不保留残端重建前交叉韧带术后膝关节退变及软骨凋亡的差异，此次研究分别建立了残端鞘内重建、牵张保残重建和不保残重建前交叉韧带3种手术动物模型，并对3种前交叉韧带重建术后膝关节退变及软骨细胞凋亡情况进行比较。假设保留残端重建前交叉韧带能够减轻膝关节退变和软骨细胞凋亡。

1、材料和方法

1.1 设计

随机对照动物实验。

1.2 时间及地点

实验于2018年12月至2019年11月在新疆医科大学动物实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物

实验共纳入雄性新西兰兔60只，6-8月龄，体质量3.0-3.5kg，由新疆医科大学动物实验中心提供，普通级、封闭群，许可证号：SCXK(新)2016-0004。实验前经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会审查通过(IACUC20160724006)，所有实验兔均术前适应性饲养1周。

1.3.2 主要仪器及试剂

酶标仪、蛋白转膜仪(Bio-Rad);电泳仪(BeijingLiuyi)；数字化电子万能生物材料试验机(瑞格尔仪器有限公司中国深圳)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒；Anti-ACTBantibody(Abcam);RabbitAnti-MMP13antibody、RabbitAnti-ACANantibody(博奥森)；bcl-2相关X蛋白抗体(博士德)；原位缺口末端标记法(TUNEL)反应液(Bio-Rad)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组及方法

采用随机数字法先将60只新西兰兔分为4组，对照组(n=15)，只切开关节囊，不离断前交叉韧带；不保残重建组(n=15)；牵张保残重建组(n=15)和残端鞘内重建组(n=15)。不保残重建组、牵张保残重建组、残端鞘内重建组均为急性期双膝前交叉韧带重建(30膝)，术后动物双下肢不制动，大腿肌肉注射青霉素40×104U/kg，连续7d，每天伤口碘伏消毒，观察伤口有无红肿、渗液及髌骨脱位。如切口愈合良好，10d后拆线。术后对照组无切口感染，不保残重建组切口感染2只，牵张保残重建组切口感染3只，牵张保残重建组感染1只。因实验为无菌手术，一旦出现手术后感染，即有可能影响实验结果，立即安乐死实验动物。重新建模，补充不保残重建组、牵张保残重建组和残端鞘内重建组数量。

1.4.2 双膝前交叉韧带重建

(1)不保残重建：动物称质量后，舒泰+速眠新肌注麻醉，消毒铺巾。切取同侧跟腱作为移植腱，长约4cm，直径2mm。膝关节屈曲位切开内侧关节囊，在股骨止点处离断前交叉韧带，完全清理前交叉韧带胫骨、股骨残端，直径2mm克氏针制作股骨、胫骨隧道，细导针牵引移植腱，通过胫骨、股骨隧道，先将移植腱的股骨端以牵引线拉紧缝合于隧道外口骨及软组织上，然后在膝关节屈曲约30°位拉紧移植腱，用牵引线将胫骨端缝合于胫骨隧道外口骨及软组织上。固定移植腱稳定后，生理盐水冲洗，逐层缝合。

(2)牵张保残重建：麻醉、手术入路、移植腱取材、股骨隧道制法同上。胫骨端隧道制法：不清理前交叉韧带胫骨残端，在前交叉韧带胫骨残端处缝1针作为牵引线，胫骨隧道内口定位在前交叉韧带足迹中心偏后1mm处，钻取胫骨隧道，移植腱由胫骨隧道外口向关节内穿入，先固定移植腱胫骨端，伸直位将前交叉韧带残端与移植腱缝合，再固定股骨端，残端引线从股骨骨道中穿过，将残端尽量向股骨隧道牵拉，给予残端一定张力。

(3)残端鞘内重建：股骨隧道定位、钻取与和移植腱固定同不保残重建，保留前交叉韧带胫骨残端，将残端小心制作成袖套状，胫骨隧道定位在原前交叉韧带残端中心，移植腱从残端中心通过，使残端将移植腱尽量包绕。

1.4.3 标本制备

术后12周时处死(过量麻醉)所有实验兔，对照组随机切取一侧后肢内侧胫骨平台软骨，取0.5cm×0.5cm×0.5cm范围大小，生理盐水冲洗，甲醛固定，石蜡包埋，常规切片，行组织学及细胞凋亡检测；另取0.5cm(长)×0.5cm(宽)×0.2cm(厚)软骨组织，液氮速冻，-80℃冰箱保存，Westernblot检测相关蛋白。手术重建组左膝关节行生物力学测试，右膝内侧胫骨平台软骨行组织学、细胞凋亡和Westernblot蛋白检测，同时观察牵张保残重建组、残端鞘内重建组移植腱-残端复合体愈合情况。

1.4.4 标本检测

(1)组织学观察：(1)苏木精-伊红染色：石蜡切片脱蜡-下行梯度乙醇水化-细胞核染色-分化-细胞核染色：0.5%伊红溶液将切片染色3min-脱水-透明：切片在二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中分别浸泡53min-封固：中性树胶封固。(2)Masson染色：石蜡切片脱蜡，自来水和蒸馏水洗，Regaud苏木精染液或Weigert苏木精液染核5-10min，充分水洗，蒸馏水洗，Masson丽春红酸性复红液5-10min,2%冰醋酸水溶液浸洗，1%磷钼酸水溶液分化，苯胺蓝或光绿液染5min,0.2%冰醋酸水溶液浸洗，体积分数95%乙醇、无水乙醇、二甲苯透明、中性树胶封固。观察残端-移植腱愈合和软骨退变情况，计算Mankin评分，分值越高说明软骨退变越严重。

(2)生物力学测试：取下膝关节标本后保留胫骨、股骨各约4cm骨性结构，使用甲基丙烯酸甲酯包埋两端骨质。剔除移植物外所有软组织(关节囊、半月板、后交叉韧带)，使用数字化电子万能生物材料试验机行拉断实验，测试时保持室温(22±2)℃，湿度40%，加载速度为2mm/min，记录最大载负荷。

(3)软骨细胞凋亡检测：采用TUNEL法，染色步骤严格按说明书进行。软骨标本常规制成切片，脱蜡、水化、封闭，蛋白酶K消化，加入TUNEL混合液，水洗，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，透明，封固。染色结果分析：凋亡细胞经染色细胞核成棕黄至褐色，染色质浓集。高倍镜下观察，每张切片随机选择6个400倍视野，计算平均凋亡指数(AI%)。AI=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

(4)Westernblot检测基质金属蛋白酶13、蛋白聚糖和Bax的蛋白水平：组织样本经液氮研磨后取100mg，加入1000μLRIPA裂解液，提取总蛋白，二喹啉甲酸法(BCA)法测定蛋白浓度，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳，转膜，封闭，一抗孵育[Bax(1∶100)；基质金属蛋白酶13(1∶500)；蛋白聚糖(1∶500)；β-actin(1∶500)]，加入二抗(1∶10000)，显色。用ChemiScopemini化学发光仪检测、拍照。

1.5 主要观察指标

(1)移植腱-残端复合体愈合情况；(2)生物力学测试结果；(3)组织学观察结果；(4)软骨细胞中相关蛋白基质金属蛋白酶13、蛋白聚糖、Bax蛋白的表达。

1.6 统计学分析

采用SPSS19.0统计软件，数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroxni检验，P<0.05为差异有显著性意义。

2、结果

2.1 实验动物数量分析

实验选取新西兰兔60只，分为4组，排除实验过程发生感染的6只，并予补充动物建模，进入结果分析60只。

2.2 移植腱-残端复合体愈合情况

保残重建后残端与移植腱的愈合情况，发现残端与移植腱之间间隙明显，残端与移植腱并未融合成一体。见图1。

2.3 生物力学测试结果

拉断试验中所有标本移植物断裂的部位都在关节腔内韧带实质部，没有移植物从骨隧道内脱出。重建各组最大拉力均小于对照组(P<0.05)；重建各组拉伸距离均大于对照组(P<0.05)；不保残重建组和与牵张保残组、残端鞘内重建组最大拉力载荷、最大拉伸距离差异均无显著性意义(P>0.05)；牵张保残组与残端鞘内重建组比较差异无显著性意义(P>0.05)，见表1。

表1|各组兔术后12周生物力学情况(±s,n=15)

2.4 组织学观察结果

(1)苏木精-伊红染色：(1)对照组：关节软骨4层结构存在，软骨表面完整，细胞排列规则，层次清楚，表层细胞平行表面，深层细胞排列成柱状；潮线完整，基质无失染；(2)重建各组：表层不平整有纤维化，表层细胞减少，染色不均匀，有裂隙，主要在表层，偶到中间层，细胞排列欠规整，簇集细胞明显增加，软骨内细胞密度不均一，潮线不规则。见图2。

(2)Masson染色：(1)对照组：关节软骨基质被染成天蓝色，染色均匀一致，细胞排列规则，软骨基质深层可见，被染成淡红色的钙化软骨存在；(2)重建各组：软骨基质被染成天蓝色，表层不光整，软骨细胞密集，分布不均，退变软骨从潮线升起很多红色火焰状的突起使未钙化软骨出现红染。见图3。

(3)关节软骨Mankin评分及凋亡指数：术后12周，重建各组Mankin评分及凋亡指数均高于对照组(P<0.05)；不保残重建组与牵张保残组、残端鞘内重建组比较差异均无显著性意义(P>0.05)，牵张保残组与残端鞘内重建组比较差异无显著性意义(P>0.05)，见表2，图4,5。

表2|各组兔关节软骨Mankin评分及凋亡指数(±s,n=15)

2.5 软骨中相关蛋白基质金属蛋白酶13、蛋白聚糖、Bax蛋白的表达

重建各组基质金属蛋白酶13、Bax表达均显著高于对照组(P<0.05)；不保残重建组与牵张保残组、残端鞘内重建组比较差异无显著性意义(P>0.05)，牵张保残组与残端鞘内重建组差异无显著性意义(P>0.05)。重建各组蛋白聚糖显著低于对照组(P<0.05)；不保残重建组与牵张保残组、残端鞘内重建组差异无显著性意义(P>0.05)，牵张保残组与残端鞘内重建组差异无显著性意义(P>0.05)，见表3，见图6。

表3|各组兔软骨中凋亡蛋白表达水平比较(±s,n=15，相对表达量)

3、讨论

此次研究建立了残端鞘内重建前交叉韧带动物模型，比较了保留残端重建前交叉韧带与不保残重建前交叉韧带术后膝关节退变和软骨凋亡是否存在差异。结果表明：与不保留残端重建前交叉韧带术式相比，保留残端重建前交叉韧带在预防膝关节软骨退变和细胞凋亡方面并没有表现出优势，研究结果和作者的假设不一致。

选取术后12周作为观察时间点是因为兔的代谢明显快于人类，动物实验已证明，如果膝关节稳定性缺失，兔2周即可出现轻度的骨性关节炎，到12周时，就可以演变为严重的骨性关节炎。研究表明前交叉韧带重建术后胫股关节仍然存在接触面压力异常和关节间隙的减小，其中内侧胫股关节面退变更明显[11,12]。所以此次实验切取内侧胫骨平台软骨作为观察对象。

既往研究显示无论是使用骨-髌腱-骨还是腘绳肌作为移植材料的单束或双束前交叉韧带不保残重建，重建术后膝关节运动、步态、胫股关节和髌股关节仍存在力学异常[13,14,15,16]。力学异常必然会使膝关节的整个载荷重新分布，稳定性降低，从而引起膝关节退变[17]。此次研究进一步证实保留残端重建前交叉韧带术后膝关节同样存在软骨退变，并且在关节软骨Mankin评分、细胞凋亡率及凋亡相关蛋白的表达方面与不保留残端重建无差别。

骨性关节炎的发生与软骨过度凋亡密切相关[18,19,20]。膝关节稳定性丧失后，关节软骨凋亡增加。在此次实验中重建各组在前交叉韧带重建后软骨细胞凋亡率升高，主要原因可能是前交叉韧带重建后膝关节稳定性未完全恢复所造成的继发软骨退变。保留残端组与不保残组没有统计学差异，说明保留残端重建前交叉韧带并没有减少软骨细胞的凋亡，异常力学刺激所诱发的膝关节软骨细胞凋亡仍然存在。

骨性关节炎特征性的病理改变是关节软骨破坏和继发性骨质增生。基质金属蛋白酶是导致软骨破坏的关键酶类，其中基质金属蛋白酶13不仅破坏构成软骨基质纤维网架主体结构的Ⅱ型胶原蛋白，还能够降解聚集蛋白聚糖、骨粘连蛋白等重要物质，使关节软骨的弹性及硬度均发生病理性退变[21]。所以基质金属蛋白酶13在骨性关节炎中起到至关重要的作用，其表达量与骨性关节炎的严重程度成正相关，是反映软骨破坏的敏感指标[22]。

聚集蛋白聚糖(ACAN)，也称为软骨特异性蛋白聚糖核心蛋白或硫酸软骨素蛋白聚糖1，是软骨基质中的重要成分，聚集蛋白聚糖的存在使关节软骨具有了抵抗压应力并分散负荷的能力。研究显示在骨性关节炎的早期，聚集蛋白聚糖就会出现丢失，其含量变化直接关系到软骨组织的退变情况[23]。Bax是Bcl-2家族蛋白中的一员,属于促凋亡蛋白[24],Bax表达增多，促进软骨细胞凋亡[25]。

此次研究中重建各组膝关节软骨中基质金属蛋白酶13、Bax蛋白高于对照组，蛋白聚糖比值低于对照组，与众多膝关节稳定性下降所致关节软骨退变的实验一致[26]。说明重建后膝关节稳定性仍未恢复正常，力学不稳定所致关节软骨退变。保留残端组与不保残组关节软骨基质金属蛋白酶13、Bax、蛋白聚糖蛋白表达无统计学差异，再一次从分子生物水平证实了保留残端重建前交叉韧带相对于传统手术在防止防止骨性关节炎方面并无显著优势。

目前的观点认为，稳定性未恢复正常是前交叉韧带重建后膝关节退变的主要原因。此次研究中保留残端重建前交叉韧带在关节退变、细胞凋亡方面与不保留残端重建无差别，可能与保留残端重建并未取得更好的膝关节稳定性有关。分析原因或许是：(1)保残重建未取得更好的生物力学性能。生物力学指标是评估前交叉韧带重建术后关节稳定性的重要参数。残端增加稳定性的前提是能够与移植腱融为一体，从而产生更大的生物力学效能。此次研究中保留残端重建组移植腱-残端愈合情况很差，在术后提供力学稳定性的装置实际上只是移植腱本身，残端并没用参与其中。众所周知，前交叉韧带损伤后韧带重建的原因就是前交叉韧带断端极难形成有效愈合。MURRAY等[27]观察前交叉韧带断裂后韧带修复时发现，虽然前交叉韧带损伤后出现了一系列的自我修复反应，但是在断裂20周后韧带断端始终不能形成有效连接。SONG等[28]对兔进行急性期牵张保残重建，术后12周发现40%残端吸收消失，未消失的残端也没有与移植腱融合。所以保留残端重建前交叉韧带对移植腱生物力学的影响极小。(2)前交叉韧带残端对增加膝关节稳定性的贡献仍不明确。回溯既往关于残端对膝关节稳定的研究，发现一些学者对残端能否改善膝关结稳定性持怀疑态度。SONG等[28]和TIE等[29]的研究表明保留残端并不能增加膝关节动态稳定性。MAEDA等[30]在术中使用精确导航技术对残端切除前后的膝关节稳定性做了对比，认为残端对控制膝关节前移的作用十分有限。

综上所述，在此次动物实验中保留残端重建前交叉韧带在预防膝关节退变及减少关节软骨凋亡方面没有显示优越性，原因可能是保留残端没有增加膝关节的稳定性。

此次研究的不足：(1)虽然新西兰兔是目前前交叉韧带重建及骨性关节炎造模常用的动物，但由于兔膝关节腔很小，无法进行镜下操作，因此此次研究中前交叉韧带重建均在切开关节囊下直视操作，与临床中关节镜下手术相比，手术创伤较大，可能会加重术后膝关节退变，致使实验误差增大，影响结果的准确性；(2)此次动物实验中，对前交叉韧带移植腱的固定为骨皮质外的缝线悬吊固定，并且手术后没有制动，可能对腱骨愈合有一定影响，因此从动物实验中得到的检测指标并不能立即指导临床实践。与传统手术相比，保留残端重建前交叉韧带能否减缓术后膝关节退变的发生，仍需长期随访的大样本、高质量的临床随机对照试验或循证医学研究来进一步证实。

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基金:新疆生产建设兵团自然科学基金资助项目(2015AD004),项目负责人:张磊.