骨质疏松是由于机体骨形成减少,骨吸收增加,导致骨骼密度降低的一种疾病｡在生理条件下,成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收共同维持着机体的骨平衡｡近年来,研究表明,线粒体在维持机体骨代谢方面发挥着重要作用｡线粒体是拥有双层膜包被的细胞器,即线粒体外膜( outermitochondrial membrane,OMM)和线粒体内膜( innermitochondrial membrane, IMM)｡OMM作为扩散屏障,主要介导细胞信号传导;IMM主要与能量代谢有关,其包含两个主要的亚室:内边界膜( innerboundary membrane,IBM)和线粒体嵴,嵴通过嵴连接到IBM,共同承载着各种通道转运蛋白[1]｡嵴的形成取决于线粒体接触位点和嵴组织系统,它通过与外膜蛋白复合物､动力蛋白相关蛋白视神经萎缩蛋白1的相互作用,在嵴连接处形成寡聚物,共同维持嵴的形成,大大增加了IMM的有效面积;另外,IMM上有电子传递链(electron transport chain,ETC)的呼吸复合物,是三磷酸腺苷( adenosinetriphosphate,ATP)合成的主要位点[2]｡线粒体是半自主细胞器,自身拥有遗传物质,即线粒体DNA(mtDNA),可根据机体的代谢需求完成自身复制｡随着现代医学的发展,研究人员发现线粒体的特定结构能影响机体骨代谢,本文通过总结线粒体mtDNA突变､线粒体膜电位(ΔΨm)变化､线粒体氧化磷酸化( oxidative phosphorylation,OXPHOS)异常和线粒体钙单向转运体( mitochondrial Ca2+uniporter,MCU)转运在调节骨代谢过程中的潜在分子机制,以期为骨质疏松症的防治提供新的思路｡

1、MtDNA突变

MtDNA是一种环状双链基因组,由16 569个碱基对组成,其中包含37个基因,编码13种线粒体蛋白､22种转移RNA和2种核糖体RNA[3]｡人类的mtDNA在不经历细胞周期的情况下,可以进行不断复制,在复制的过程中,有部分mtDNA会发生突变,细胞中拥有的正常mtDNA能中和部分突变mtDNA所产生的影响,当突变mtDNA的数量超过正常mtDNA时,与突变类型所涉及的相关的疾病在人体中占主导地位,这种现象称为阈值效应[4]｡随着年龄增长,体细胞mtDNA突变在人体组织中积累,这些变异可能会导致衰老表型[5]｡

早期研究报道,细胞中mtDNA突变的大量累积所引起的线粒体功能障碍和呼吸链缺陷是衰老过程中相关代谢性疾病的原因[6]｡mtDNA突变的患者骨质疏松的患病率和骨折的风险明显增高,例如,G11778A位点突变､7301bp的缺失(范围从核苷酸位置6530~13831)和m. 3243A>G突变都会加速机体骨质流失[7⁃9]｡随着科学技术的发展,科学家已经模拟出相关的mtDNA突变小鼠,例如, PolG⁃D257A型小鼠(编码mtDNA聚合酶PolGγ基因突变的小鼠)和ΔmtDNA小鼠( mtDNA核苷酸位置7759~12454缺失小鼠)[10⁃11]｡研究显示,这两种突变小鼠在10月龄时股骨的骨密度和破骨细胞活性类似于正常27月龄小鼠[12]｡

目前研究较多的是PolG⁃D257A型小鼠模型,它是第一个证明mtDNA突变在早衰表型中具有致病作用的模型,该模型小鼠以正常小鼠3 ~ 5倍的速度,迅速积累大量的导致早衰的突变mtDNA,在饲养40周时,全身的骨密度显著降低并伴有骨骼肌减少症[13⁃14]｡临床研究显示,40 ~ 80岁老年患者体内,成骨细胞线粒体呼吸链中复合物Ⅰ､Ⅱ､Ⅳ､Ⅴ存在明显缺陷,其中复合物Ⅰ及其相关蛋白NDUFB8和NDUFA13缺陷最为明显[15]｡进一步研究显示,与同龄的野生型小鼠相比,PolG⁃D257A型小鼠的成骨细胞和破骨细胞中线粒体呼吸链蛋白细胞色素c氧化酶亚基1(COX⁃I,复合物Ⅳ)和NDUFB8水平明显下降,胫骨BV/ TV降低､骨形成速率降低､成骨细胞群体密度降低､破骨细胞活性增加且破骨细胞群体密度增加[16]｡以上结果说明,mtDNA突变会影响细胞内线粒体功能障碍和呼吸链缺陷,并加速机体骨质流失｡另外,Yang等[17]研究表明,PolG⁃D257A型小鼠能损害肠道干细胞Wnt / β⁃catenin信号通路的传导,众所周知,Wnt / β⁃catenin信号通路在成骨细胞分化过程中扮演重要角色,但该研究尚未揭示PolG⁃D257A型小鼠骨细胞中的Wnt / β⁃catenin信号通路转导作用机制｡除此之外,研究发现ΔmtDNA小鼠骨密度和皮质骨厚度降低,这是由于其体内血清甲状腺素水平较正常小鼠显著升高,使破骨细胞向皮质骨表面募集,骨吸收增加,导致皮质骨厚度减少并引起骨质疏松[18]｡另外,研究者也较为关注m. 3243A>G突变,它与骨骼过早老化有关,其特征是骨量减少､结构和强度受损[19]｡其中,线粒体未折叠蛋白反应(UPRmt)在这个过程中发挥重要作用,它能保护线粒体免受错误折叠或突变蛋白造成的损伤｡当细胞遭受外界环境的刺激(例如氧化应激)或细胞内代谢改变时,会造成线粒体内蛋白质构造异常,若大量的变性或错误折叠的蛋白质不能被降解,ATF5从线粒体移易位至细胞核,激活并启动UPRmt[20]｡以促进线粒体热休克蛋白(Hsp10 / Hsp27 / Hsp60 / mtHsp70)和相关蛋白酶降解未折叠或错误折叠的蛋白质,从而重建线粒体蛋白稳态｡Gao等[21]研究显示,m. 3243A>G突变能损害尿源性间充质干细胞(USCs)线粒体的结构和功能,使线粒体嵴结构异常､线粒体肿胀､膜电位降低及线粒体裂变/融合的百分比降低,激活了UPRmt,降低了与成骨细胞相关的Wnt配体Wnt7B以及Wnt信号转导成分GSK3B的表达,ATF5敲除后,细胞内显示出高水平的Runx2､OCN和BMP2｡另有研究显示,在肠道干细胞中,通过补充烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)前体烟酰胺单核苷酸(NMN)能逆转上述变化,高水平的NAD能减少线粒体ROS的产生和减轻线粒体损伤,延缓细胞衰老｡但是目前m. 3243A>G突变在骨质疏松领域的相关研究尚未深入[17]｡以上结果为更好地了解m. 3243A>G突变患者诱发骨质疏松的机制提供了新的见解｡

综上所述,细胞内mtDNA突变的积累会加速细胞衰老并驱动机体骨质疏松的发生｡但是根据最新的研究显示,机体也存在一套降解突变的mtDNA的系统｡先前的研究一直认为,线粒体裂变过程1(MTFP1)作为一种线粒体内膜蛋白,它能作用于动力相关蛋白1( dynamin⁃related protein1,Drp1)上游的促分裂因子,将分裂过程与驱动细胞命运决定的多个关键通路进行偶联[22]｡Julien等[23]研究发现MTFP1抑制IMM融合,防止改变的IMM亚结构域与健康的线粒体网络融合,通过外周分裂使它们分离,随后被自噬降解,这有助于机体降解突变的mtDNA并维持生理状态下的mtDNA水平｡目前,大多研究较为关注mtDNA突变与糖尿病､视神经病变和听力障碍等疾病之间的关系,并通过流行病学调查､临床研究和基础研究逐渐揭示了其内在作用机制｡虽然目前mtDNA突变在骨质疏松领域的作用尚未得到充分的验证,但有部分数据已经证明mtDNA影响骨表型和细胞衰老,表示该方面在未来有较为广泛的研究前景｡

2、ΔΨm变化

线粒体包含OXPHOS和糖酵解2种能量代谢途径｡糖酵解的最终产物之一丙酮酸通过IMM上的丙酮酸载体转运至线粒体基质中,并在丙酮酸脱氢酶的作用下转化为乙酰辅酶A(Acetyl⁃CoA)并进入TCA循环,在这个过程中,NAD和黄素腺嘌呤二核苷酸( flavin adenine dinucleotide,FAD)被还原为NADH和FADH2,然后,这些被还原的电子在ETC复合物Ⅰ､Ⅱ的作用下被转移辅酶Q,辅酶Q将这些电子带到复合物Ⅲ中,并在细胞色素c( cytochromeC,Cyt⁃c)的作用下转移至复合物IV中｡在这个过程中ETC复合物Ⅰ､Ⅲ和Ⅳ的电子转移活动与质子泵入线粒体膜间空间耦合,在IMM上产生电化学质子梯度,从而产生ΔΨm[24⁃25]｡

ΔΨm与线粒体ATP的合成和ROS的产生有关｡IMM上的ETC复合物V在质子梯度的驱动下,将二磷酸腺苷( adenosine diphosphate,ADP)分子与无机磷酸盐结合以产生ATP,再通过腺嘌呤核苷酸转运蛋白( adenine nucleotide translocator, ANT)将ATP转运至膜间空间[26]｡正常情况下,细胞内ΔΨm和ATP水平处于稳定,但当机体处于某些应激状态时,细胞将会启动ANT逆转功能,其将ATP逆转入细胞基质中形成ADP并将质子泵出线粒体膜间空间以维持ΔΨm并延缓细胞衰老和凋亡[27]｡另外,相关研究表明,线粒体ATP合酶相关的线粒体疾病中,ΔΨm增加与高ROS水平有关;在与ETC亚基相关的疾病中,ΔΨm降低与高ROS水平有关[28]｡除此之外,ΔΨm可以通过调节线粒体质量控制(例如线粒体融合､线粒体裂变和线粒体自噬)来调节机体骨代谢｡对于线粒体融合和裂变来讲,融合过程需要线粒体融合蛋白1 / 2( mitofusin⁃1/ 2,Mfn1 / 2)和视神经萎缩1 ( optic atrophy protein,OPA1)的参与;裂变过程需要动力学相关蛋白1(dynamin⁃related protein1,Drp1)的参与[29]｡相关研究显示,低水平的ΔΨm导致的线粒体融合事件更小,这可能是因为ΔΨm的降低与OPA1的水解相关[30]｡另外,Drp1介导的线粒体裂变水平的增加会使ΔΨm降低｡丙酮酸激酶肌肉同工酶2(PKM2)是调节线粒体糖酵解的一种限速酶,其能抑制骨髓间充质干细胞( bone marrow mesenchymalstem cells,BMSCs)向成骨细胞的分化[31]｡最近Guo等[32]研究发现,PKM2促进线粒体裂变基因DRP1､FIS1和MFF的表达,并抑制线粒体融合基因OPA1和MFN2的表达,在这个过程中伴随着ΔΨm的降低｡对于线粒体自噬来讲,先前的研究已经表明,ΔΨm的变化在细胞发生线粒体自噬之前,依赖于ΔΨm⁃PINK1⁃Parkin蛋白通路的激活[33]｡随着研究的不断深入,线粒体自噬和ΔΨm水平逐渐在骨细胞中被揭示,Kruppel样因子2在增加成骨细胞中Wnt5a､β⁃catenin､LRP6和Runx2的表达促成骨的过程中,细胞中ΔΨm升高,并伴随自噬通路相关蛋白LC3B⁃II､Beclin1､ATG5和ATG7表达的增加[34]｡

以上结果表明, ΔΨm能通过调节线粒体内ATP､ROS和线粒体质量控制来调节机体的骨代谢过程｡目前,大多数研究集中在对ΔΨm的表型观察,因此更深一步的机制需要被研究｡

3、OXPHOS异常

如前所述,线粒体的OXPHOS是细胞能量代谢途径之一,该过程需要IMM上的ETC复合物(复合体Ⅰ､Ⅱ､Ⅲ和Ⅳ)和复合体V(ATP合酶)的共同参与,电子在呼吸复合物之间转移以产生ATP｡

研究显示,机体的成骨细胞增殖和分化需要大量的ATP,这主要依赖于线粒体OXPHOS而不是糖酵解过程,并且已证明OXPHOS到糖酵解的转变是机体骨质流失的主要因素[35]｡用糖酵解抑制剂草酸钠干预成年小鼠8周后,显示小鼠骨骼系统中糖酵解变化水平降低,OXPHOS水平升高,小鼠的小梁骨密度和皮质骨体积显著增加[36]｡另外,Guo等[37]通过使用鱼藤酮和TTFA分别抑制MC3T3⁃E1细胞线粒体ETC复合物Ⅰ和Ⅱ的活性,结果显示成骨细胞的分化受到抑制,这说明线粒体OXPHOS是成骨细胞增殖和分化过程中的主要能量来源｡同样,线粒体OXPHOS与破骨细胞分化有关,研究表明,Sirt3⁃KO小鼠中与年龄相关的骨质流失可能是由于破骨细胞中的OXPHOS水平降低,且抑制破骨细胞中OXPHOS供能途径发现,破骨细胞的分化受到显著抑制[38]｡

以上结果表明,相对于糖酵解,线粒体OXPHOS供能途径在骨代谢方面扮演着更为重要的角色,OXPHOS代谢异常会影响成骨细胞和破骨细胞的分化,进一步深入研究两者之间的作用机制可能是防治骨质疏松的潜在途径｡

4、MCU

转运细胞中的内质网和线粒体之间的接触已被证明在Ca2+的转移中发挥重要作用｡紧密的内质网⁃线粒体接触结构使内质网释放的Ca2+被线粒体摄取,这种摄取的Ca2+需要MCU的转运,MCU是线粒体唯一的一个钙离子单向转运通道蛋白,存在于IMM中,是钙离子进入线粒体基质中的主要介质[39]｡在细胞有丝分裂早期,细胞内ATP水平下降,这会激活MCU,促进大量Ca2+进入线粒体基质中维持细胞能量稳态和细胞有丝分裂｡线粒体内适度的Ca2+能激活脱氢酶(FAD⁃甘油磷酸脱氢酶､丙酮酸脱氢酶､NAD⁃异柠檬酸脱氢酶和酮戊二酸脱氢酶)的活性并促进OXPHOS过程产生更高水平的ATP;但过高水平的Ca2+会促使线粒体打开通透性过度孔而引起细胞凋亡[40]｡

体外研究表明,老年骨质疏松患者体内MCU表达水平升高｡体内研究显示,在巨噬细胞诱导的破骨细胞中,随着诱导天数的增加,细胞中MCUmRNA､NFATc1､Mmp9､Ctsk水平显著增加,进一步研究表明,在破骨细胞分化早期,MCU主要通过增加线粒体内Ca2+水平,促进ATP的产生以维持破骨分化,在破骨细胞分化中后期,线粒体通过产生活性氧促进破骨细胞的分化｡另外,他们证明MCU不参与成骨细胞的分化[41⁃42]｡除此之外,微RNA(MicroRNA,miRNA)是已被证明使一类重要的转录后调节因子,其在机体骨代谢过程中发挥重要作用[43⁃44]｡先前的一项研究显示, MCU的表达与miR⁃25的表达呈显著负相关,并证实了MCU是miR⁃25的直接靶点[45]｡Hu等[46]研究发现,在Ti颗粒诱导的RAW264. 7细胞的破骨成骨细胞分化过程中,miR⁃25的过表达显著降低了MCU mRNA的水平,使线粒体基质中Ca2+减少,这与先前的研究结果一致,另外他们检测到与破骨细胞分化相关的转录因子NFATc1 mRNA和NF⁃κB mRNA的表达显著降低,这表明miR⁃25的表达能通过降低MCU水平来抑制破骨细胞分化｡

以上研究表明,MCU与机体破骨细胞分化存在一定的联系｡在此之前的研究多关注在细胞膜上的Ca2+转移,例如BK通道,其已被证明在调节BMSCs､成骨细胞和破骨细胞中发挥重要作用[47]｡但是目前关于MCU在骨代谢方面的研究相对较少,其在抗骨质疏松方面的研究还有待进一步深入｡

5、总结

随着现代细胞生物学研究的不断深入,线粒体被证明是一个复杂的细胞器,其内包含DNA､ΔΨm､各种转运蛋白､脂质以及相关离子等,这说明线粒体能通过多种代谢方式影响细胞的功能｡线粒体蛋白质代谢､脂质代谢和氨基酸代谢过程等也已被证明是影响机体骨代谢的重要因素,由于文字的限制,本文重点从mtDNA突变､ΔΨm变化､OXPHOS异常和MCU转运角度出发,论述了其在调节骨代谢中的作用机制｡PolG⁃D257A型小鼠､Mito⁃miceΔ小鼠和m. 3243A>G小鼠通过影响线粒体ETC､体内血清甲状腺激素水平和线粒体裂变/融合过程调节机体骨代谢;ΔΨm可以通过调节线粒体ATP､ROS､线粒体融合､裂变和线粒体自噬过程影响机体骨代谢;相对于糖酵解途径,线粒体OXPHOS在调节成骨细胞和破骨细胞分化过程中扮演者重要角色;MCU不参与成骨细胞分化,在破骨细胞中,主要通过增加线粒体内Ca2+水平,促进ATP的产生以维持破骨分化｡虽然目前的研究已经取得了一定的进展,但是研究不够深入,进一步研究这些机制将为从线粒体途径防治骨质疏松提供坚实的理论基础｡

基金资助:国家自然科学基金(81973878);江苏省中医退行性骨关节疾病临床创新中心项目(2021040501);无锡市“双百”中青年医疗卫生拔尖人才项目(BJ2023069);

文章来源:刘小峰,刘亚兰,储旭东,等.线粒体相关功能障碍在骨代谢研究中的作用机制进展[J].中国骨质疏松杂志,2025,31(08):1212-1217.