91学术服务平台

您好，欢迎来到91学术官网！站长邮箱：91xszz@sina.com

学术期刊分类

首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 外科论文 > 骨科论文 > miR-224在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用机制

论文咨询

miR-224在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用机制

2021-09-25 94 上传者：管理员

摘要：目的探讨miR-224对骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨分化的影响及其机制。方法体外以成骨诱导培养基培养hBMSCs,采用Western印迹法和碱性磷酸酶(ALP)活性测定试剂盒检测成功分化标志物骨钙素(OCN)、成骨特异性转录因子(Runx)2蛋白和ALP活性。采用脂质体2000转染miR-224mimics和Smad4siRNA干扰序列分别上调miR-224和下调Smad4表达,以实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western印迹法检测miR-224和Smad4表达情况,采用荧光素酶报告基因实验检验miR-224与Smad4的靶向关系。结果随hBMSCs诱导分化时间的延长,miR-224表达降低,而Smad4表达升高。上调miR-224后,成骨分化相关指标ALP活性、OCN和Runx2蛋白表达减弱,Smad4蛋白表达下降;荧光素酶实验证实Smad4是miR-224的靶基因,下调其表达后,成骨分化相关指标ALP活性、OCN和Runx2蛋白表达减弱。结论miR-224可通过靶向Smad4抑制hBMSCs成骨分化。

关键词：
miR-224
Smad4
成骨分化
骨髓间充质干细胞
加入收藏

骨髓间充质干细胞(hBMSCs)是一类具有多向分化潜能的干细胞，在特定环境下可诱导分化成为成骨细胞，调控骨的生长发育。因hBMSCs具有来源广泛、易分离培养和分化潜能大等特点，被认为是治疗骨质疏松等骨组织损伤修复的理想种子细胞[1]。然而，如何使hBMSCs单向成骨分化一直是制约临床修复效率的关键。微小RNA(miRNA)是一类内源性非编码小RNA,可与相关靶基因3′UTR区结合抑制其翻译进而影响细胞的增殖、凋亡和分化等多种生物学过程。研究[2,3,4]证实，miRNA在hBMSCs成骨分化过程中发挥着重要作用。有学者发现，miR-224在hBMSCs成骨分化过程中低表达，但其具体的作用及调控机制尚不清楚[5]。因此，本研究通过体外培养hBMSCs并诱导其成骨分化后，采用常规生物学手段上调miR-224表达，观察其对hBMSCs成骨分化的影响，并通过靶基因预测软件预测相关靶基因，探讨其可能的分子机制。

1、材料与方法

1.1材料

人hBMSCs、诱导成骨分化的DMEM培养液、hBMSCs培养液ORICellTM和Opti-MEM培养液购自中国赛业生物公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司，胰蛋白酶购自美国Sigma公司。成骨特异性转录因子(Runx)2、骨钙素(OCN)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、SMAD同源物(Smad4)一抗和辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购自英国Abcam公司。miR-224模拟物(mimics)、miR-control、Smad4siRNA干扰序列和阴性对照序列均购自上海吉凯公司，脂质体2000购于美国Introvigen公司。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒购自美国Omega公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒、逆转录试剂盒、RNA抽提试剂盒和电化学发光(ECL)检测试剂盒购自上海碧云天公司，碱性磷酸酶(ALP)活性检测试剂盒购自南京建成生物公司。双荧光素酶活性检测试剂盒购自美国Promega公司。

1.2hBMSCs培养

采用ORICellTM培养液将hBMSCs培养在含5%CO2的37℃恒温培养箱中，每3d换1次培养基。待细胞几乎铺满培养瓶底时，加入0.25%胰酶消化，以1∶3比例传代。实验使用第5代细胞。

1.3hBMSCs成骨分化的诱导

取6孔板，每孔接种100μl浓度为105个/ml的hBMSCs,常规条件下培养24h后，加入由10%胎牛血清、0.2mmol/L抗坏血酸、1%谷氨酰胺、10nmol/L地塞米松和10mmol/Lβ-磷酸甘油构成的诱导成骨分化的DMEM培养液，每3d换液1次的，诱导培养12d。分别在第0、3、6、9和12d收集细胞，进行后续实验。

1.4细胞转染

将未分化的hBMSCs以每孔105个细胞接种24孔板，常规条件下培养24h后，换成无血清的Opti-MEM培养基，采用Lipofectamine2000转染试剂将miR-224mimics(终浓度为50nmol/L)及阴性对照(终浓度为50nmol/L)转至未分化的hBMSCs中。转染6h后，换成成骨诱导培养基继续培养。Smad4siRNA干扰序列和阴性对照序列的转染过程同上。

1.5qRT-PCR检测miR-224表达

RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA,逆转录试剂盒反转录合成cDNA。根据由美国Invitrogen公司合成的miR-224引物(上游：5′-GCGAGGTCAAGTCACTAGTGGT-3′和下游5′-CGAGAAGCTTGCATCACCAGAGAACG-3′)和U6引物(上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和下游5′-AACGCTTCACGAATTT-GCGT-3′)进行PCR定量分析，以U6作内参，检测miR-224的表达。

1.6ALP活性检测

收集成骨诱导培养的hBMSCs,采用ALP检测试剂盒检测ALP活性，根据公式：ALP活性=测定管吸光度值/总蛋白克数。

1.7Runx2、OCN和Smad4蛋白检测

收集成骨诱导培养的hBMSCs,磷酸缓冲液洗涤后，以加蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液裂解细胞提取总蛋白。采用BCA蛋白检测试剂盒对蛋白浓度定量后，以4∶1比例将蛋白样品与5×十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液混合，沸水浴变性后，进行凝胶电泳。待蛋白分离结束后，转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。常温下以含5%脱脂奶粉封闭液封闭1h后，加入特异性一抗4℃下孵育过夜，封闭液洗涤后，HRP标记的二抗常温孵育1h。暗室内加入ECL试剂显影曝光，以GAPDH为内参，检测目的蛋白的表达情况。

1.8荧光素酶实验

由上海吉凯公司构建Smad43′-UTR野生型(含Smad43′-UTR目的片段)和Smad43′-UTR突变型(含Smad43′-UTR突变体)质粒。将对数生长期的hBMSCs随机分为野生型Smad4+miR-224mimics组、野生型Smad4+miR-control组、突变型Smad4+miR-224mimics组和突变型Smad4+miR-control组，使用Lipofectamine2000转染miR-224mimic及Smad43′-UTR野生型或突变型，转染48h后，使用双荧光素酶活性检测试剂盒检测细胞荧光素酶活性。

1.9数据分析

采用SPSS21.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2、结果

2.1hBMSCs的成骨分化能力

成骨诱导培养0、3、6、9和12d,ALP活性由(0.11±0.02)U/g依次上升为(0.23±0.03)U/g、(0.45±0.03)U/g、(0.67±0.05)U/g和(0.89±0.06)U/g。与0d相比，随着诱导时间的延长，hBMSCs的ALP活性显著升高(P<0.05),且在12d时达到最大。在0～12d的5个成骨培养时间点下OCN蛋白的相对表达量分别为0.13±0.02、0.21±0.02、0.28±0.03、0.36±0.02和0.43±0.03;Runx2蛋白的相对表达量分别为0.25±0.02、0.33±0.03、0.39±0.02、0.46±0.03和0.58±0.03。与0d相比，OCN和Runx2蛋白的表达水平也均随诱导时间的延长而明显升高(P<0.05)。可见，hBMSCs的成骨分化能力良好。见图1。

2.2hBMSCs成骨分化过程中miR-224和Smad4的表达

qRT-PCR检测结果显示，miR-224的相对表达水平从0d的1.00±0.06到第3天降为0.88±0.06,第6天降为0.74±0.05,第9天降为0.55±0.03,至12d降至最低，为0.43±0.03;可见，miR-224在hBMSCs成骨分化过程中的表达水平随着时间的延长逐渐降低(P<0.05);Western印迹法检测结果(图2)显示，在0～12d的5个成骨培养时间点下，Smad4蛋白的相对表达量(0.26±0.03、0.35±0.02、0.44±0.03、0.53±0.04和0.72±0.05)则随成骨诱导时间的增加而显著升高(P<0.05)。

2.3上调miR-224表达抑制hBMSCs向成骨细胞分化

将miR-224mimics转至hBMSCs后，qRT-PCR检测miR-224的表达水平明显升高(1.00±0.05vs5.53±0.12,P<0.05)。同时，ALP活性[(0.85±0.06)U/gvs(0.37±0.03)U/g,P<0.05]、OCN蛋白(0.39±0.04vs0.15±0.02)和Runx2蛋白(0.52±0.05vs0.32±0.03)的表达水平均显著降低(P<0.05)。如图3可见，上调miR-224表达抑制hBMSCs向成骨细胞分化。

2.4miR-224靶向Smad4抑制hBMSCs向成骨细胞分化

以miRGEN软件预测miR-224的靶基因发现，Smad4是miR-224的一个潜在靶基因。miR-224与Smad4有相关的绑定位点[6],见图4A。为了验证miR-224与Smad4间的靶向关系，以Western印迹检测Smad4蛋白表达发现，上调miR-224后Smad4蛋白的表达明显下降(0.68±0.05vs0.46±0.03,P<0.05),见图4B。同时，根据荧光素酶报告实验检测细胞的荧光素酶活性发现，与共转染Smad4突变体和miR-224阴性对照相比，共转染Smad4突变体和miR-224mimics细胞的荧光素酶活性无明显改变(1.06±0.08vs1.01±0.11,P>0.05);但是，与共转染Smad4野生型和miR-224阴性对照相比，共转染Smad4野生型和miR-224mimics的细胞荧光素酶活性明显降低(0.57±0.04vs0.35±0.02,P<0.05)。可见，miR-224可抑制Smad4的表达，进而抑制hBMSCs向成骨细胞分化。

2.5下调Smad4的表达抑制hBMSCs向成骨细胞分化

Smad4siRNA使细胞中Smad4蛋白表达显著降低(0.57±0.08vs0.26±0.02,P<0.05);同时发现成骨分化相关蛋白OCN(0.45±0.03vs0.29±0.02)和Runx2(0.56±0.04vs0.40±0.03)的表达也明显减弱(P<0.05);此外，ALP活性也从对照的(0.83±0.05)U/g降为(0.52±0.03)U/g,差异显著(P<0.05)。见图5。可见，下调Smad4的表达能够抑制hBMSCs向成骨细胞分化。

3、讨论

miR-224作为miRNAs家族中的重要成员，可通过调控不同的靶基因或信号通路参与细胞的生物学过程。miR-224是一种与肿瘤发生发展关系密切的基因，在多种肿瘤中异常表达，可发挥促癌基因或抑癌基因的作用参与细胞的生物活动。如Wang等[7]研究指出，miR-224在非小细胞肺癌患者组织中表达上调，上调其表达可通过靶向调节RAS相关区域蛋白(RASSF)8促进非小细胞肺癌细胞增殖；Lin等[8]发现，miR-224在前列腺癌组织中低表达，上调其表达可通过下调Tribbles同源蛋白(TIRB)1抑制癌细胞的增殖、侵袭和迁移，并促进细胞凋亡。除参与肿瘤细胞的发生发展外，miR-224还参与干细胞的分化。如Na等[9]研究发现，miR-224在小鼠的精原干细胞中高表达，可通过靶向Mab-3相关转录因子(DMRT)1表达促进精原干细胞的分化。Choy等[10]报道称，小鼠胚胎干细胞神经分化过程中miR-224异常表达，过表达的miR-224通过靶向神经元周期昼夜蛋白-芳基烃受体核转运蛋白-专一蛋白Per-Arnt-Sim(PAS)结构域蛋白(NPAS)4延缓了早期神经分化。hBMSCs是骨组织工程中的重要种子细胞，深入研究其定向成骨分化的机制对提高干细胞修复组织缺损具有重要意义。有学者[5]发现，miR-224在hBMSCs成骨分化过程中低表达，但其具体的作用及调控机制尚不清楚。OCN和Runx2是成骨分化的的标志蛋白，ALP活性是反映成骨活性和成骨能力的量化衡量标准[11,12]。本研究结果提示miR-224在成骨分化中发挥着重要的负向调控作用。

基因在机体内的调控网络是一个庞大而又复杂的过程，同一个miRNA可调控多个靶基因，参与细胞的生理过程，发挥不同的作用。Chen等[13]指出，miR-224通过靶向白细胞分化抗原(CD40L)参与调节氧化低密度脂蛋白(oxLDL)刺激的树突细胞成熟过程和促炎性细胞因子分泌；而Liu等[14]发现miR-224可通过靶向调控酰基辅酶A脱氢酶(ACADM)和乙醛脱氢酶(ALDH)2基因参与乳腺上皮细胞凋亡和三酰甘油产生。同时，一个靶基因又受到多个miRNA的共同调控，发挥不同的功效。如Lee等[15]研究证实，miR-431通过靶向Smad4促进老年骨骼肌的分化和再生；Zhang等[16]发现，miR-146b-5p可通过直接靶向Smad4促进多能干细胞的神经转化；同时，Anderson等[17]在软骨细胞形成过程中发现，miR-483可靶向Smad4抑制人hBMSCs向软骨细胞分化。李钧等[18]在非创伤性股骨头坏死骨髓基质干细胞成骨分化过程中发现，miR-125b可靶向Smad4参与骨髓基质干细胞成骨分化与增殖。

肿瘤生长因子(TGF)-β是骨代谢过程中重要的转化因子，其在间质干细胞成骨分化过程中发挥着重要的促进作用[19,20],Smad4作为Smad家族中的重要成员，可将TGF-β信号转致胞核，发挥转录因子的功能，参与间质干细胞成骨分化过程[21,22]。提示miR-224可负向调控Smad4参与hBMSCs成骨分化。同时，荧光素酶报告实验进一步证实了Smad4是miR-224靶基因。证实了miR-224是通过靶向Smad4抑制了hBMSCs成骨分化。但Smad4对hBMSCs成骨分化的抑制作用明显低于miR-224。猜测，miR-224可能还通过其他途径参与hBMSCs成骨分化过程。

综上，miR-224通过靶向Smad4抑制hBMSCs成骨分化。这一结果为miR-224和Smad4有望成为治疗骨折愈合和骨质疏松等骨骼疾病的药物靶点提供了参考依据。同时，miR-224除了通过靶向Smad4调控hBMSCs成骨分化外，可能还存在其他的调控机制，还需进一步研究。

参考文献：

[1]谢纪荣，黄鑫，牟亚群，等.中性粒细胞外泌体诱导骨髓间充质干细胞分泌成血管相关因子的研究[]实用口腔医学杂志，2020,36(4):562-6.

[2]陈熙，郭健民，邹军.microRNA在成骨分化和骨代谢疾病中对Wnt信号通路调控作用的研究进展[J].中国老年学杂志，2016,36(24)6293-5.

文章来源：张浩,王拥军,桑敬伟,张文,杨卫兵,高雁卿,张紫机.miR-224在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用机制[J].中国老年学杂志,2021,41(18):4040-4044.

分享：

91学术论文范文

相关论文

推荐期刊

网友评论

加载更多

我要评论

临床骨科杂志

期刊名称：临床骨科杂志

期刊人气：5046

期刊详情

主管单位：安徽省教育厅

主办单位：安徽医科大学,安徽省医学会

出版地方：安徽

专业分类：医学

国际刊号：1008-0287

国内刊号：34-1166/R

邮发代号：26-147

创刊时间：1998年

发行周期：双月刊

期刊开本：大16开

见刊时间：10-12个月

论文导航

查看更多

相关期刊

热门论文

网站导航

会员中心

关于我们

服务项目

科普杂志阅读、期刊信息查询、论文下载、文献查询、原创文章检测等多项服务。

服务热线

【91学术】（www.91xueshu.com）属于综合性学术交流平台，信息来自源互联网共享，如有版权协议请告知删除，ICP备案：冀ICP备19018493号

微信咨询

返回顶部

发布论文

上传文件

发布论文

您的论文已提交，我们会尽快联系您，请耐心等待！

知道了

用户注册

找回密码

你的密码已发送到您的邮箱，请查看！

确定