流行病学调查显示,心血管疾病是全球病死率最高的疾病之一,其中又以冠心病的病死率最高,且呈逐年上升的趋势[1,2,3]。中医学调查研究发现,冠心病中医证候多属本虚标实、虚实夹杂的复合证型,最常见的证候为气虚血瘀证[4]。炎症反应在冠心病的发生发展中发挥重要作用,Toll样受体4/核因子-κB(toll-likereceptor4/nuclearfactor-κB,TLR4/NF-κB)是经典的炎症信号通路。TLR4是一类主要参与机体固有免疫反应的特异性受体,可广泛存在于心肌细胞中,当心肌受到外源性及内源性等多种刺激后,其能够识别多种细胞信号。髓样分化因子(myeloiddifferentiationfactor,My D)88是沟通TLR4与NF-κB的桥梁蛋白,其经过一系列反应,进而释放NF-κB进入细胞核,转录形成包括白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor,TNF)-α等在内的炎症因子,放大炎症级联反应[5]。益气活血方(Yiqi HuoxueFormula,YQHXF)是课题组在治疗糖尿病性心肌病气阴两虚、痰瘀互结证的加味生脉补心丹的基础上进一步完善的处方,具有补气活血的功效,被用于治疗冠心病气虚血瘀证[6,7]。本研究旨在探索益气活血方对冠心病气虚血瘀证大鼠TLR4/My D88/NF-κB信号通路介导的炎症反应的调控作用,以期为阐明益气活血方治疗冠心病的作用机制提供实验依据。实验方案已通过湖南中医药大学实验动物伦理委员会审查,批件编号:LL2021010803。

1、材料

1.1 动物

48只雄性SD大鼠,体质量180～200 g,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,动物许可证号:SCXK(湘)2019-0004。所有大鼠饲养于湖南中医药大学实验动物中心,环境温度20～25℃,相对湿度40%～60%,光照条件为12 h明/12 h暗,自由摄食摄水。

1.2 药物

单硝酸异山梨酯片(国药准字H10940039,20 mg×48片,批号07201217),购于鲁南贝特制药有限公司。益气活血方颗粒剂组成:黄芪、丹参、太子参、当归、桂枝、水蛭、红花、甘草,由湖南省中医药研究院制备,温开水混匀供大鼠灌胃使用。

1.3 主要试剂及仪器

RNA提取试剂盒(货号:A2A1667),湖南艾科瑞生物工程有限公司;逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(货号:0521751、0520331),上海近岸科技有限公司;TLR4鼠抗、My D88鼠抗(货号:B1221、L2220),美国SantaCruz公司;NF-κBp65兔抗(货号:8242S),美国CST公司;β-actin兔抗(货号:AA1217J1199ZJ1),南京巴傲得生物科技有限公司;山羊抗兔Ig G、山羊抗鼠Ig G(货号:511203、511103),成都正能生物技术有限责任公司;通用二步法检测试剂盒、二聚氨基联苯胺(3,3'-diaminobenzidine,DAB)试剂盒(货号:2121D0401、2131A0322),北京中杉金桥生物技术有限公司;大鼠IL-1β、IL-6、TNF-αELISA试剂盒(货号:E-EL-R0012c、E-EL-R0015c、E-EL-R2856c),武汉伊莱瑞特生物科技有限公司。

Sono Scape-S2N超声机,深圳开立科技有限公司;ECG-2303B心电图机,广州市三锐电子科技有限公司;SA-6600全自动血液流变测试仪,北京赛科希德科技股份有限公司;HM325石蜡切片机,美国Thermo公司;YD-A生物组织摊片机,金华市益迪医疗设备有限公司;BA410E光学显微镜,厦门麦克奥迪实业集团有限公司;Light Cycler480实时荧光定量PCR仪,瑞士Roche公司;TLR4、My D88、NF-κBp65引物由上海生工公司合成。

2、方法

2.1 分组与模型建立

48只雄性SD大鼠适应性喂养7 d后随机分为假手术组、模型组、益气活血方组、单硝酸异山梨酯组,共4组,每组12只。除假手术组外,其余3组大鼠行冠状动脉结扎术。具体方法如下:大鼠麻醉后仰卧位固定于鼠板,备皮,气管切开,小动物呼吸机维持呼吸(呼吸频率70次/min,潮气量2 m L/100 g,呼吸比1.25:1),随后沿左侧第3、4肋间隙剪开皮肤,钝性分离胸肌,暴露心脏,在左心耳下方用缝合线结扎冠状动脉左前降支,结扎完成后缝合肌肉和皮肤。连接心电图,记录术后心电图变化。冠状动脉结扎术成功标准:ST段弓背抬高或上斜型抬高或水平型抬高≥0.1 m V,见图1。假手术组大鼠只穿线不结扎。术后7 d,除假手术组外,其余大鼠强迫游泳14 d,并控制大鼠的食量,以制备气虚血瘀证大鼠模型。强迫游泳具体步骤为:将大鼠放入自制的40 cm×30 cm×50 cm游泳箱内游泳,水温22～25℃,水深30 cm,保证大鼠尾部无法接触箱底,待大鼠沉入水中,头面在10 s内不能浮出水面时将其捞出,擦身,放回鼠笼,以游泳后大鼠精神萎靡、四肢无力为准,见图2。

2.2 给药

强迫游泳第1天开始灌胃给药,以体表面积比率换算法计算大鼠给药剂量,将单硝酸异山梨酯溶于0.9%氯化钠溶液,给药剂量为3.6 mg/kg;益气活血方溶于温开水,给药剂量为17.1 g/kg,模型组和假手术组大鼠采用与给药组相同体积的0.9%氯化钠溶液在相同时间点灌胃,各组大鼠均连续灌胃给药28 d。

图1 大鼠冠状动脉结扎术前后心电图   

图2 大鼠游泳力竭图   

2.3 心脏超声检测心功能

给药28 d后,所有存活大鼠异氟烷麻醉(浓度3%,流速0.5 L/min)并固定于鼠板上,去除大鼠胸前区毛发,探头上涂抹适量超声耦合剂,沿胸骨长轴调整合适角度,观测大鼠左心室射血分数(left ventricularejectionfraction,LVEF)和短轴缩短率(leftventricularfractionalshortening,LVFS)。

2.4 样本收集

心脏超声检测完成后,腹主动脉取血,随机选取6只大鼠用肝素钠采血管采集5 m L左右新鲜血液,采血管上下颠倒8～10次,使血液与肝素钠充分混匀。剩余大鼠用普通采血管采集5 m L左右新鲜血液,离心后取上清,-80℃保存,用于后续ELISA检测。取血完成后,所有大鼠剥离心脏组织。其中随机选取4只大鼠,将灌注针经左心室伸入升主动脉,用0.9%氯化钠溶液灌注全身后取心,将心脏置于4%多聚甲醛中浸泡,用于后续心肌苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色、Masson染色和免疫组化检测。将剩余大鼠心脏损伤部位进行修剪后置-80℃保存,用于后续的荧光定量PCR检测。

2.5 全血黏度检测

在4 h内将肝素钠采血管置于血液流变检测仪中,按默认程序检测各组大鼠全血黏度的低、高切值。

2.6 HE染色检测心脏损伤程度

大鼠心脏经4%多聚甲醛固定后脱水、透明、包埋,制成5μm厚切片,先后进行苏木精染色、伊红染色、脱蜡、透明、封片,光镜(×200倍)下观察各组大鼠心肌病理学改变并拍照。

2.7 Masson染色检测心肌纤维化程度

将石蜡切片脱蜡至水,制成5μm厚切片,经过苏木素染色、酸性乙醇分化液分化、Masson蓝化液返蓝、丽春红品红染色液染色、苯胺蓝染色液染色、脱水、透明、封片后在光镜(×200倍)下观察各组大鼠心肌病理学改变并拍照,用Imagej2.0软件计算各组大鼠心肌纤维化的面积。

2.8 免疫组化检测心肌中TLR4、My D88和NF-κBp65的表达

将石蜡切片脱蜡至水,制成5μm厚切片,抗原修复,TLR4(1:200)、My D88(1:200)、NF-κBp65(1:1000)一抗4℃孵育过夜;滴加鼠/兔通用二抗,显色,苏木素复染,透明,封片。光镜(×200倍)下观察并拍照,用Imagej2.0软件进行分析,以平均光密度(averageopticaldensity,AOD)值代表蛋白的相对表达量。

2.9 荧光定量PCR检测心肌中TLR4、My D88和NF-κBp65的m RNA表达

取各组大鼠于-80℃冻存的心肌组织,Trizol法提取总RNA,检测其浓度和纯度,将RNA反转录合成c DNA后扩增,扩增采用20μL反应体系。以β-actin为内参基因,采用2-△△Ct法计算各组大鼠心肌中TLR4、My D88与NF-κBp65的m RNA表达量。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成,引物序列见表1。  

表1 引物序列表 

2.1 0 ELISA检测血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量

将ELISA试剂盒、大鼠血清样品置于室温复温,严格按照试剂盒说明书对IL-1β、IL-6、TNF-α的含量进行检测。

2.11统计学方法

采用SPSS25.0软件进行统计学分析。计量资料以均值±标准差表示,符合正态性、方差齐性者多组间比较采用单因素方差分析,组间比较采用LSD法;若不满足方差齐性则采用Dunnett-T3检验。P<0.01表示差异有统计学意义。

3、结果

3.1 益气活血方对冠心病气虚血瘀证大鼠心功能的影响

冠心病会影响心脏功能,心脏超声可用于评估心脏的各项功能参数。与假手术组比较,模型组大鼠的LVEF和LVFS值显著下降(P<0.01)。与模型组比较,益气活血方组和单硝酸异山梨酯组大鼠的LVEF和LVFS值均明显上升(P<0.05),提示益气活血方和单硝酸异山梨酯均能改善冠心病气虚血瘀证大鼠的心功能,见表2。  

表2 各组大鼠心脏超声检测结果比较  

3.2 益气活血方对冠心病气虚血瘀证大鼠全血黏度的影响

通过全血黏度检测可以了解心血管疾病的进展和预后。与假手术组比较,模型组大鼠在低切和高切下的全血黏度明显升高(P<0.01)。与模型组比较,益气活血方组和单硝酸异山梨酯组大鼠在低切和高切下的全血黏度明显下降(P<0.01),说明益气活血方和单硝酸异山梨酯均能降低冠心病气虚血瘀证大鼠的血瘀程度。与单硝酸异山梨酯比较,益气活血方在低切下的效果更显著(P<0.01),见表3。  

表3 各组大鼠全血黏度比较 

3.3 益气活血方对大鼠心肌形态学的影响

随着结扎部位心肌缺血的进展,心肌组织会发生病理变化,通过HE染色可观察心肌组织的形态学改变。与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织排列紊乱,心肌大面积坏死,形成瘢痕组织,充斥于正常组织之间。与模型组比较,益气活血方和单硝酸异山梨酯干预后,损伤的大鼠心肌组织均有所好转,瘢痕组织减少,组织排列较整齐,其中以益气活血方的改善效果最明显,见图3。

图3 各组大鼠心肌HE染色结果(×200)   

3.4 益气活血方对大鼠心肌纤维化的影响

Masson染色常用于检测组织中胶原纤维的分布情况。在Masson染色实验中,正常肌纤维被染成红色,而胶原纤维呈蓝色。与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织胶原纤维丰富,提示心肌纤维化程度严重(P<0.01)。与模型组比较,经益气活血方和单硝酸异山梨酯干预后,大鼠心肌纤维化程度显著下降(P<0.01)。与单硝酸异山梨酯组比较,益气活血方组大鼠心肌纤维化改善更明显(P<0.01),见图4、表4。

图4 各组大鼠心肌Masson染色结果(×200)    

表4 各组大鼠心肌纤维化阳性率比较 

3.5 益气活血方对心肌中TLR4、My D88和NF-κBp65m RNA表达量的影响

荧光定量PCR相对定量结果显示,与假手术组比较,模型组大鼠心肌TLR4、My D88与NF-κBp65的m RNA表达量均升高(P<0.01)。与模型组比较,益气活血方组和单硝酸异山梨酯组大鼠心肌TLR4、My D88与NF-κBp65的m RNA表达量均下降(P<0.01)。与单硝酸异山梨酯组比较,益气活血方组大鼠以上指标的m RNA表达量下降更显著(P<0.05),见图5。

图5 各组大鼠心肌中TLR4、My D88和NF-κB p65 m RNA表达量比较(n=5)   

3.6 益气活血方对心肌中TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白表达量的影响

免疫组化染色结果显示,TLR4、My D88和NF-κB p65的阳性表达为棕黄色。与假手术组比较,模型组大鼠心肌中TLR4、My D88和NF-κBp65的阳性表达升高(P<0.01)。与模型组比较,益气活血方组和单硝酸异山梨酯组大鼠心肌中TLR4、My D88与NF-κBp65的阳性表达均降低(P<0.01)。与单硝酸异山梨酯组比较,益气活血方组大鼠上述指标的阳性表达下调更明显(P<0.01),见图6、表5。

图6 各组大鼠心肌组织免疫组化染色结果(×200)     

表5 各组大鼠心肌TLR4、My D88、NF-κB p65免疫组化阳性n=4)表达量比较  

3.7 益气活血方对血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量的影响

ELISA结果显示,与假手术组比较,模型组大鼠的IL-1β、IL-6、TNF-α血清含量均升高(P<0.01)。与模型组比较,益气活血方组和单硝酸异山梨酯组大鼠的IL-1β、IL-6、TNF-α血清含量均下降(P<0.05)。与单硝酸异山梨酯组比较,益气活血方组大鼠的IL-6血清含量下降更显著(P<0.01),见表6。

表6 各组大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α血清含量比较  

4、讨论

在治疗冠心病气虚血瘀证的临床实践中发现,益气和活血相辅相成,单用益气则瘀不散,独用活血则气不充,益气活血并用方使气助血行,瘀去而脉利,使痹阻之心脉得以畅通[8,9,10]。益气活血方主要由丹参、黄芪、当归、太子参、桂枝、水蛭、桃仁、红花、甘草组成,具有补气活血的功效,适用于治疗冠心病气虚血瘀证。其中丹参、当归活血补血,桃仁、红花活血祛瘀,水蛭破血逐瘀,黄芪、太子参益气滋阴,桂枝温阳通脉,甘草调和诸药,共奏益气活血之效。现代药理学研究表明,益气活血方具有抗动脉粥样硬化、抗心肌纤维化、抑制细胞凋亡、保护心肌细胞、抗炎、抗氧化、保护血管内皮、抑制血小板聚集等作用[11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23]。

冠心病大鼠模型制备方法主要有通过喂养高脂饲料复制动脉粥样硬化的病理过程[24],注射垂体后叶素或异丙肾上腺素复制缺血缺氧的过程[25,26],以及结扎冠状动脉直接阻断冠脉血流等[27]。《灵枢·五味》曰“谷不入半日则气衰,一日则气少矣”,《素问·举痛论篇》曰“劳则喘息汗出,外内皆越,故气耗矣”。一方面,饮食物长期摄入不足可致气血生化乏源;另一方面,长期过度疲劳,劳则耗气,饥劳交作,久则气虚[28]。此两条为气虚血瘀证大鼠模型制备的主要依据,故研究人员一般通过使大鼠长期处于疲劳状态以及限制进食的方法来制备该模型。本研究通过“冠脉结扎+控制食量+强迫游泳”的方法建立了冠心病气虚血瘀证大鼠病证结合模型。

心电图是确诊冠心病及判断冠心病动物模型造模是否成功的重要依据,心脏超声能够通过影像学观察模型大鼠的心脏舒缩功能[29],全血黏度检测可帮助了解瘀血程度[30],通过病理学检测则能够观察到冠心病由心肌缺血向心肌梗死发展过程中心肌细胞的坏死与心肌纤维化水平[31]。本研究结果发现,与假手术组比较,模型组大鼠心电图ST段明显抬高,心功能LVEF、LVFS参数明显降低,全血黏度显著升高,心肌组织大面积坏死、纤维化;与模型组比较,经过药物治疗后,大鼠心功能好转,全血黏度显著降低,心肌纤维化程度有所减轻,提示益气活血方与单硝酸异山梨酯均能改善冠心病气虚血瘀证大鼠的心功能;其中,益气活血方在改善低切状态下的全血黏度以及减轻心肌纤维化方面效果优于单硝酸异山梨酯。

TLR4/NF-κB是一条经典的炎症信号通路。TLR4是与人体免疫相关的受体,能识别各种病原分子,在抗炎机制中发挥重要作用。NF-κB在调控细胞生长、凋亡、免疫、炎症、应激反应等方面具有重要作用,在哺乳动物中该家族有5种蛋白,分别为:Rel A(p65)、Rel B、c-Rel、NF-κB1(p50)和NF-κB2(p52),其中以p65最为关键[32]。My D88是沟通TLR4和NF-κB的桥梁蛋白[33]。在受到炎症刺激时,TLR4/My D88/NF-κB通路被激活,激活的NF-κB进入细胞核后又会转录释放促炎细胞因子,如IL-1β、IL-6、TNF-α等,形成恶性循环[32,33]。IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子能加速脂质沉积、引起血小板聚集、使斑块失稳破裂、加速心肌纤维化,进而影响冠心病的进程[34,35,36,37]。本研究结果发现,与假手术组比较,模型组大鼠TLR4、My D88、NF-κBp65、IL-1β、IL-6、TNF-α表达量升高,提示大鼠在发生心肌缺血时,会激活TLR4/My D88/NF-κB信号通路,使NF-κB逆转录释放IL-1β等炎症因子,级联放大炎症反应,加重心肌损害。与模型组比较,经过药物治疗后,大鼠TLR4、My D88、NF-κBp65、IL-1β、IL-6、TNF-α表达量均有不同程度的下降,提示益气活血方和单硝酸异山梨酯能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路,减少炎症因子的释放,从而发挥治疗作用。且益气活血方在下调TLR4、My D88、NF-κBp65、IL-6方面的作用优于单硝酸异山梨酯,提示益气活血方通过抑制TLR4/My D88/NF-κB信号通路改善冠心病气虚血瘀证大鼠炎症反应的作用更佳。

综上所述,益气活血方能抑制TLR4/My D88/NF-κB信号通路减少IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子的释放,进而对冠心病气虚血瘀证大鼠起到治疗作用。由于益气活血方的成分复杂,其具体机制有待进一步研究。

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基金资助:湖南省自然科学基金面上项目(2019JJ40214);湖南省中医药科研计划一般项目(2021121);湖南省中医药科研计划项目(202004);湖南省教育厅优秀青年项目(21B0081); 湖南省中医药管理局一般项目(D2022027);

文章来源:陈善达,汪顺伟,欧颖等.益气活血方对冠心病气虚血瘀证大鼠TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的影响[J].中国中医基础医学杂志,2024,30(02):226-231.