原发性免疫球蛋白A肾病(IgAN)是常见的原发性肾小球肾炎，以镜下血尿和轻度蛋白尿为主要症状，常见于亚洲人群[1]。IgAN的确诊需要行肾活检，且临床常采用免疫荧光显微镜鉴定IgA沉积[2]。尽管在IgAN机制研究方面取得了一些零散的进展，但关于特定调节机制的研究仍少见，目前IgAN的发病机制尚不完全清楚。B淋巴细胞刺激因子(BLyS)同增殖诱导配体(APRIL)是通过诱导促生存基因的表达维持B细胞库和体液免疫的关键因素，并在许多不同的自身免疫性疾病中，血清BAFF水平会升高[3-4]。BAFF通过与3种独特的受体[BAFF受体、穿膜蛋白活化物(TACI)和B细胞成熟抗原]结合在B细胞的存续中发挥至关重要的职能[5]。

TACI-Ig是一种新型重组融合蛋白，包含人免疫球蛋白G(IgG)的Fc成分和TACI受体的配体结合结构域[6],是一种BAFF/APRIL双重抑制剂，其经过我国相关部门审批已用于系统性红斑狼疮患者，并成功治疗1例膜性肾病[7-8]。Toll样受体4(TLR4)因在先天免疫中识别病原体相关分子的作用而闻名，并参与IgAN的发病机制[9]。有研究表明，TLR4在IgAN患者中表达升高，并且考虑与疾病严重程度相关。当TLR4介导的脂多糖接触肠黏膜上皮细胞时，可直接损伤肠黏膜功能并刺激B细胞活化产生低亲和力IgA,进而诱导IgAN发生[10]。有研究表明，对ddY小鼠给予TLR4相关刺激后，会提高血清低半乳糖基化IgA1(Gd-IgA1)水平，表明其参与了IgAN的发病机制[11]。当TLR4活性被触发，通过髓样分化因子88(MyD88)依赖性途径激活核转录因子κB(NF-κB)。IgAN患者肾活检研究显示，NF-κB的表达与不良预后相关，且与炎症有显著相关性，炎症是肾小球疾病的关键因素[12]。本研究采用不同方法检测TLR4/NF-κB蛋白表达，探讨TACI-Ig治疗IgAN的机制。

1、材料与方法

1.1 实验动物

24只Sprague-Dawley(SD)大鼠，无菌级，雄性，体重180～200 g, 购自北京大学医学部(实验动物科学部),动物许可证：SCXK(京)2021-0013。由内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院医学伦理委员会批准[2023伦理审查(临)第(014)号],大鼠饲养于包头医学院实验动物中心，动物饲养在特定通风的笼子，在恒温、恒湿且无病原体房间，自由获取食物和水。

1.2 试剂

牛血清清蛋白、脂多糖购自北京索莱宝公司；四氯化碳、蓖麻油购自上海麦克林生化科技有限公司；兔抗大鼠IgA抗体购自北京博奥森公司；Gd-IgA1酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自江苏酶免实业有限公司。RNA提取试剂盒购自天根(北京)生化科技公司，反转录试剂盒购自日本TAKARA公司；通用荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂盒购自美国Biosharp公司。

1.3 方法

1.3.1 大鼠IgAN模型建立及分组

采用孙红旭等[13]的免疫诱导法建立IgAN模型，牛血清清蛋白以纯水配置成浓度为150 g/L的溶液，剂量600 mg/kg, 隔天灌胃，持续12周；皮下注射蓖麻油(0.3 mL)+四氯化碳(0.1 mL)混合物，每周1次，持续9周；在第6、8、10周尾静脉注射脂多糖0.05 mg, 直至实验结束。各组随机处死1只大鼠进行肾组织免疫荧光及病理染色，观察肾组织结构改变情况。免疫荧光染色结果显示，在系膜区沉积了IgA免疫复合体，则表明模型成功构建。将大鼠随机分为正常对照组、模型组、药物对照组(给予醋酸泼尼松5 mg/kg)和TACI-Ig组，每组6只。在IgAN模型建立成功后，TACI-Ig组给予TACI-Ig 14.36 mg/kg, 以16 mg/mL水平溶于无菌注射液中进行皮下注射，隔天1次，共计8周。正常对照组、模型组给予等药物剂量体积生理盐水。

1.3.2 肾功能检测

尿蛋白是IgAN的重要生物标志物，为探讨TACI-Ig对IgAN大鼠肾损伤是否具有减缓症状、保护肾脏作用，本研究检测了IgAN大鼠24 h尿蛋白定量(24h-UP)及血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平。所有大鼠进食被限制，自由饮水的同时采集24 h尿液。对大鼠尿液进行3 000 r/min的低速离心，去除沉淀，然后采用双缩脲法，检测各组大鼠24h-UP的波动情况；尾静脉采集大鼠静脉血液，静置30 min后，4 ℃下3 000 r/min离心收集上清后，采用全自动生化分析仪测定血清Scr、BUN水平。

1.3.3 肾脏组织取样

按上述方案治疗8周后，称取每只大鼠体重。实验结束后，采集大鼠腹腔动脉血样，血样在室温静置30 min后，4 ℃条件下3 000 r/min离心20 min, 之后收集血清，在—80 ℃下保存。部分组织先使用10%中性福尔马林预处理保存，石蜡包埋，进行后续组织病理学检查。将剩余肾脏组织经过预先冷却的磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗，浸干并冷冻保存在—80 ℃。

1.3.4 Gd-IgA1水平检测

采用ELISA试剂盒检测血清Gd-IgA1水平，按照酶联免疫吸附法操作说明书稀释标准品并加样，在ELISA酶标板待测样品孔上加入样品稀释液40 μL,加样品10 μL,同时设置空白孔。37 ℃孵育半小时。小心取出密封酶标板，丢弃液体。残余液体被拍干后，采用洗涤液灌洗每个孔道，静置30 s后拍弃，重复5次。空白孔除外，每孔加入50 μL ELISA酶标试剂。37 ℃孵育30 min, 然后进行如上所述的清洗。避光37 ℃条件下孵育15 min后，加停止液，终止反应过程。450 nm波长下测定吸光度值(加入停止液15 min内)。

1.3.5 肾组织苏木素伊红(HE)染色

首先将包埋好的肾脏组织切片，切成厚度为4 μm。常规HE染色。随后观察染色切片的组织病理学特征，并通过光学显微镜观察肾小球系膜区细胞及基质的增生情况。

1.3.6 免疫荧光染色

肾皮质使用特殊化合物包埋，制备冰冻切片，切片厚度6 μm。4 ℃丙酮固定15 min后，使用PBS洗涤，用0.5%柠檬酸盐缓冲液渗透。接下来，使用PBS溶液(其中含有5%山羊血清)进行室温封闭30 min, 随后在4 ℃条件下与一抗IgA(1∶100)孵育整夜。去除一抗，PBS洗涤后，与抗鼠二抗在37 ℃孵育1 h后，染色5 min。

1.3.7 蛋白免疫印迹法检测

冷冻肾组织使用含有苯甲基磺酰氟和磷酸酶抑制剂的高效组织裂解缓冲液获得肾组织匀浆。使用核蛋白提取试剂盒提取蛋白。采用聚氰基丙烯酸正丁酯试剂测定组织裂解后的蛋白水平。蛋白样品用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后将凝胶蛋白转移到聚偏氟乙烯膜上，用5%脱脂牛奶封闭膜1.5 h, 并在4 ℃下与下列一抗孵育：TLR4(66350,1∶1 000)、MyD88(67969,1∶2 000)、NF-κB p65(AF5006,1∶1 000)、β-actin(21338,1∶5 000)。山羊抗鼠抗体(SA00001-1,1∶5 000)和山羊抗兔抗体(L3012,1∶5 000)在室温下孵育1.5 h。用化学发光试剂盒显示免疫反应蛋白条带，然后用ImageJ6.0软件进行定量分析。β-actin作为对照，所有样本重复测量3次。

1.3.8 实时荧光定量PCR检测

使用TRNzol Universal 总RNA提取试剂从肾组织中提取RNA,并用作模板通过逆转录生成cDNA。引物由上海生工公司合成。实时荧光定量PCR均严格按照试剂盒说明进行操作，收集各组循环阈值。使用 TaqMan Universal Master mix(Applied Biosystems)和Stratagene Max 3000p检测系统或ABI 7300实时PCR系统进行实时PCR分析。

1.4 统计学处理

采用SPSS20.0软件进行统计学分析。计量资料以

表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 各组24h-UP及血清Scr、BUN水平比较

模型组24h-UP水平显著高于正常对照组，而TACI-Ig组、药物对照组24h-UP水平显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组血清Scr、BUN水平高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。TACI-Ig组血清Scr水平低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。药物对照组血清Scr、BUN水平与TACI-Ig组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1各组24h-UP、Scr、BUN水平比较

2.2 TACI-Ig对肾脏损害的影响

TACI-Ig组、药物对照组肾组织系膜区沉积免疫复合体的增加受到明显抑制。模型组肾组织系膜细胞增殖明显，且系膜基质出现扩张，并出现不同程度的炎性细胞浸润。TACI-Ig组肾小球系膜基质扩张和炎症细胞渗透的病理变化表现出可逆转趋势。TACI-Ig可通过抑制免疫复合体的沉积来减轻肾脏损害。见图1、2。

图1肾组织免疫荧光染色图

2.3 各组血清Gd-IgA1水平比较

正常对照组、模型组、TACI-Ig组、药物对照组血清Gd-IgA1水平分别为(17.63±0.92)、(47.35±1.11)、(33.36±3.40)、(40.35±2.93)pg/mL,各组间比较差异有统计学意义(F=145.842,P<0.01)。模型组大鼠血清Gd-IgA1水平高于正常对照组，而低于TACI-Ig组，差异有统计学意义(P<0.01)。药物对照组血清Gd-IgA1水平低于模型组，而高于TACI-Ig组，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.4 各组TLR4、MyD88、NF-κB蛋白水平比较

模型组TLR4、MyD88、NF-κB蛋白水平高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.001)。TACI-Ig组TLR4、MyD88、NF-κB蛋白水平低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、药物对照组NF-κB蛋白水平比较，差异有统计学意义(P=0.023),而TLR4、MyD88蛋白水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。药物对照组TLR4、MyD88蛋白水平高于TACI-Ig组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2和图3。

图2肾组织HE染色图(400×)

表2各组TLR4、MyD88、NF-κB蛋白水平比较

2.5 各组TLR4、MyD88、NF-κB mRNA水平比较

模型组TLR4、MyD88、NF-κB mRNA水平高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。TACI-Ig组TLR4、MyD88、NF-κB mRNA水平低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。TACI-Ig组、药物对照组TLR4、MyD88、NF-κB mRNA水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

图3肾组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白图

表3各组TLR4、MyD88、NF-κB mRNA水平比较

3、讨论

IgAN是世界范围内最常见的原发肾小球疾病[14],其发病机理颇为复杂，目前尚未找到特效治疗方案，主要的治疗策略包括对蛋白质、盐分摄入的管理，应用激素或(和)联合免疫抑制剂等[15]。有研究发现，尿Gd-IgA1水平可作为早期筛选潜在IgAN的生物标志物，IgAN可能与黏膜屏障功能障碍、炎症反应和局部免疫反应有关[16]。

BAFF是B细胞的重要的稳态细胞因子，有助于调节先天和适应性免疫反应。BAFF和APRIL是参与B淋巴细胞发育和自身发育的关键蛋白，可溶性BAFF和APRIL在患有自身免疫性疾病的个体的血清和靶器官中高水平表达[3,17]。有研究发现，过度表达BAFF的转基因小鼠具有系膜沉积的IgA和异常糖基化、高循环水平的聚合IgA。APRIL参与IgAN的发病机制，并介导病理性Gd-IgA1的过度产生[18]。因此，测定BAFF、APRIL和Gd-IgA1对评价机体免疫损伤状态具有重要的指导作用[19]。前期研究证明，IgA肾病模型组血清BAFF、APRIL水平显著高于正常模型组，提示模型组大鼠处于肾脏损伤状态[20]。本研究选用TACI-Ig作为干预手段，以BAFF和APRIL为针对靶点，对IgAN大鼠进行了深入研究。

TACI-Ig是一种新型BAFF/APRIL双重抑制剂[7]。TACI-Ig的IgAN适应证得到了美国食品和药物管理局(FDA)的批准，且FDA免除了其在美国的Ⅰ期临床试验，直接进入Ⅱ期临床试验[20]。TACI-Ig可在IgAN中发挥作用。本研究为了模拟IgAN对肾脏的影响，建立了IgAN大鼠模型，采用免疫荧光染色和血清Gd-IgA1水平评价活体肾脏损害情况。免疫荧光染色通常用来表征IgAN所致的肾脏损害。本研究结果显示，TACI-Ig可降低BAFF/APRIL和Gd-IgA1表达，可观察到IgAN大鼠肾组织荧光沉积减少。

当TLR4 介导的脂多糖接触肠黏膜上皮细胞时，可直接损伤肠黏膜功能并刺激B细胞产生IgA,进而诱导IgAN发生[9-10]。机体的免疫系统利用TLR4/NF-κB通路来防范炎症、免疫失调等疾病的发生。当TLR4活性被触发时，可通过MyD88依赖性途径激活NF-κB。有研究表明，患有不孕症的IgAN小鼠肠道菌群失调可导致肠黏膜屏障受损，并诱导TLR4信号通路激活，从而介导肾脏损害[21]。Gd-IgA1通过TLR4信号通路传导产生，并与IgG、IgM和补体C3一起诱导肾炎[22]。因此，TLR4/NF-κB可能是IgAN的重要调节通路。有研究结果表明，在IgAN大鼠肾组织中，NF-κB信号被激活，NF-κB p65表达显著增强，提示TLR/NF-κB通路参与了IgAN大鼠的发病过程；TACI-Ig抑制了TLR4/NF-κB通路的激活，可减轻肾脏损害，提示BAFF/APRIL参与了IgAN大鼠的发病过程，而TACI-Ig在IgAN大鼠病程中起着至关重要的缓解作用。

综上所述，TACI-Ig对IgAN有较好的治疗作用，可改善IgAN大鼠肾功能，抑制肾小球系膜基质扩张和系膜细胞增殖。TLR4/NF-κB通路参与了IgAN大鼠的发病过程，其激活最终导致肾小球损伤。TACI-Ig可抑制TLR/NF-κB通路激活，在IgAN发病中起着至关重要作用。

参考文献:

[13]孙红旭,卢嫣,王怡.免疫源性IgAN大鼠模型的建立与评价[J].中国中西医结合肾病杂志,2019,20(1):8-10.

[15]徐丽梨,王伟铭.IgA肾病的治疗进展[J].临床肾脏病杂志,2023,23(2):70-74.

基金资助:包头市卫生健康科技计划重点项目(2024wsjkkj62);

文章来源:孙建华,李增艳,陈欣楠.TACI融合蛋白对免疫球蛋白A肾病大鼠肾脏损害的影响[J].现代医药卫生,2024,40(15):2539-2543+2547.