作为重要的先天免疫模式识别受体，Nod样受体蛋白炎症小体在参与动脉粥样硬化的病理生理学机制以及介导缺血性脑卒中的炎性损伤中发挥着关键的作用，而编码NLRP3炎症小体组分的基因变异会影响其介导的炎症反应。至目前为止，NLRP3炎症小体的组分NLRP3和胱天蛋白酶募集域蛋白8的基因变异在慢性炎症性疾病中的遗传学效应被广泛研究，但结论相互矛盾，且IS领域很少有学者涉足。本文综述了近来关于NLRP3和CARD8的单核苷酸多态性在IS及其他慢性炎症性疾病发病中的交互作用的研究，NLRP3炎症小体有望成为IS的富有前景的治疗靶点。

一、NLRP3炎症小体在IS发病机制中的研究进展

1.NLRP3炎症小体在缺血性脑损伤中可能的调控机制

一项2013年的研究发现，NLRP3炎症小体在脑缺血低氧后被激活，NLRP3、凋亡相关微粒蛋白及半胱天冬氨酶-1(caspase-1）等的表达增加，著者团队发现给予caspase-1抑制剂后,缺血-再灌注损伤得到减轻，而静脉注射免疫球蛋白后，模型动物的梗死体积和模型动物的死亡率下降，因免疫球蛋白可以抑制NLRP3炎症小体的激活，揭示了在脑缺血-再灌注损伤的免疫炎症机制中NLRP3炎症小体的作用关键[1]。2014年，同一研究团队通过间歇性地使脑缺血后的模型动物空腹，下调了核因子κB(nuclearfactorkappabeta,NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase,MAPK）信号转导通路，因而抑制了NLRP3炎症小体的活化，缺血-再灌注损伤得以减轻[2]。另有研究证实，在神经元细胞中，氧-葡萄糖剥夺可以诱导dsRNA的积聚，启动NLRP3和促炎细胞因子的产生，这些参与了脑缺血的炎症进展和损伤[3]。

2.NLRP3炎症小体的激活

NLRP3炎症小体是一种大分子量的胞浆蛋白复合体，由NLRP3、接头蛋白ASC和效应蛋白Pro-caspase-1(caspase-1的前体）组成。当配体（胆固醇结晶、β-淀粉样蛋白、溶酶体裂解成分、活性氧等内源性危险信号及细菌、病毒等多种外源性因素）结合到NLRP3的亮氨酸富集结构域（leucinerichrepeats,LRR）后，激活了NLRP3，活化的NLRP3诱导自身寡聚化，再通过NLRP3的热蛋白结构域（pyrin-domain,PYD）与ASC的PYD的相互作用与ASC形成复合物，再由ASC的caspase募集域（caspaserecruitmentdomain,CARD）募集下游的Pro-caspase-1形成炎症小体，于是caspase-1被自身激活，活化后的caspase-1进一步促进了具有生物活性的IL-1β和IL-18的激活和释放，IL-1β和IL-18作为重要的促炎细胞因子，广泛参与了AS及缺血性脑损伤的全过程，在先天免疫中发挥了关键的作用。

3．针对NLRP3炎症小体的靶向药物

目前抗IL-1β药物己被广泛应用于多种IL-1β参与发病机制的炎症性疾病的治疗，临床疗效确切。研究发现，抑制IL-1β信号途径可以使急性心肌梗死后的心肌重构得到有效改善，抗IL-1β药物有望成为治疗或预防冠心病的有效药物。近来研究发现，雌激素和黄体酮可以在蛋白水平调控ASC和NLRP3，并在大鼠短暂局灶缺血模型中降低炎症小体组分的表达[4]。

2015年lto等[5]阐述了Bruton酪氨酸蛋白激酶（Bruton'styrosinekinase,BTK）可作为NLRP3和ASC交互作用的平台而发挥作用，激活caspase-1形成NLRP3-ASC-caspase-1炎症级联反应通路，文中首次证实脑缺血后BTK的激活与NLRP3炎症小体的活化明确关联；在脑缺血-再灌注模型，BTK诱导的炎症小体的激活大部分发生于浸润的巨噬细胞或中性粒细胞中，给与BTK抑制剂依鲁替尼后NLRP3炎症小体的激活被抑制，从而脑梗死体积及神经功能损伤明显减轻，BTK抑制剂有望成为IS富有前景的治疗靶点[5]。

二、胱天蛋白酶募集域蛋白8(caspaserecruitmentdomain-containingprotein8,CARD8)

全基因组关联分析表明，9p21位点与IS显著相关，ANRIL(antisensenoncodingRNAintheINK4locus）是9p21区影响AS进展的最主要的候选基因之一，在AS中作用关键，而ANRIL调控的重要的下游靶向基因就是CARD8[6]。既往研究表明CARD8也是NLRP3炎症小体的衔接蛋白分子，并提出一个模型，即NLRP3炎症小体包括NLRP3、ASC、CARD8、Pro-caspase-1。Ito等[7]发现内源性的NLRP3只有在休眠的状态下才与CARD8结合，当细胞内源性刺激物超过一定的域值，NLRP3就会与ASC结合而非CARD8，因此CARD8可以控制NLRP3于非活性状态，这种反向调控作用是通过其FIIND(functiontofind）结构域与NLRP3的核苷酸结合寡聚化结构域（nucleotide-bindingandoligeomerizationdomain,NOD）的结合抑制了NLRP3的寡聚化来实现的。同时Ito等[7]还发现CARD8不能减少包含突变的NLRP3基因在内的炎症小体诱发的IL-1β的分泌，这可能源于突变的NLRP3逃脱了CARD8的控制，导致了患者体内不必要的NLRP3炎症小体的激活。另一方面，CARD8还能反向调节NF-κB的活化（IS发生时，NF-κB可被特异性激活，从而诱导相关基因的表达，产生Pro-IL-1β和Pro-IL-18等前炎症因子，与缺血性脑损伤的炎症机制相关密切），同时具有抗凋亡作用。于是CARD8毫无悬念地逐渐引人瞩目，成为了AS及IS免疫炎症机制中非常关键的因素。

三、NLRP3炎症小体组分基因NLRP3和CARD8分子遗传学的研究现状

研究表明，IS是一种遗传及环境因素相互作用的多基因遗传病。有国外学者认为NLRP3炎症小体组分基因的变异可能会影响IS的发生和结局，但至目前为止，关于NLRP3炎症小体的组分基因在IS发病中的遗传学效应的探索甚少，而在其他慢性炎症性疾病中的研究方兴未艾。

1.NLRP3基因多态性与炎症性疾病

目前研究最多的NLRP3基因的单核苷酸多态性是rs35829419(c.2113C>A,Q705K)[8]和rs10754558[9]，研究证明上述的SNPs都是“功能获得性”的突变。rs10754558位点位于NLRP3基因的3’UTR区，其小等位G使NLRP3mRNA3’UTR的稳定性得以提升，从而提高了NLRP3mRNA的表达[9]。关于NLRP3基因的SNPs(rs35829419、rs10754558)与多种炎症性疾病易感性的关联研究已有很多[10,11,12,13]，如NLRP3rs10754558位点的多态性与冠状动脉疾病的发生显著相关，携带G等位基因的人群具有更严重的冠状动脉狭窄[10];NLRP3rs35829419的SNPs在女性群体中可以抑制心肌梗死的进展[13]。但在IS方面的研究仅有一项：2015年来自中国的一项研究报道，NLRP3rs10754558位点的多态性影响了IS的发病风险[14]，文中揭示小等位G明显提高疾病进展的风险。

2.CARD8基因多态性与炎症性疾病

CARD8功能性SNPrs2043211位于CARD8基因第五个外显子内，是CARD8基因模版链上A到T碱基的变化(c.30T>A,p.C10X)，形成终止密码Cys10Stop，因而表达丧失了抑制NF-κB激活功能的截断的CARD8蛋白，使得Pro-IL-1β的产生过多，而后者正是NLRP3炎症小体信号转导通路的底物。许多研究证实，CARD8rs2043211多态性与IS[6]、类风湿性关节炎（rheumatoidarthritis,RA)[12]、炎症性肠病[15]、下肢动脉硬化闭塞症[16]、多发性骨髓瘤[17]、慢性髓系白血病[18]、肺外结核等[19]众多慢性炎症性疾病的易感性相关，然而纵观以往的大量研究，结论是相互矛盾的：CARD8rs2043211的小等位T增加了炎症性肠病的易患性[15];rs2043211的T等位基因在隐性遗传模式下降低了IS的患病风险[6];2013年一项关于AS与CARD8基因的关联研究[20]指出：相比于取自移植供体的对照组织，人类AS斑块中CARD8mRNA高表达，携带次等位基因者与斑块中CARD8的低表达相关，但此研究同时也发现，IL-1β、IL-18的mRNA表达与CARD8rs2043211位点的SNPs无关联。

而在另外一些研究中[21,22,23]，著者并未发现CARD8rs2043211或NLRP3rs35829419的SNPs与炎症性疾病易感性的关联。鉴于上述结论的种种矛盾，2012年Ben等[24]对此做出解释：NLRP3炎症小体复合物的组分基因及NOD2基因中多态性的存在正是这种矛盾的原因所在。

3.NLRP3和CARD8基因SNPs间的交互作用与炎症性疾病易感性的关联

科研小组在查阅了大量的文献资料后发现[25]，在多蛋白复合物NLRP3炎症小体免疫炎症机制的研究中，仅分析多蛋白复合物单一组份基因的多态性是有失偏颇的，很难客观地体现NLRP3炎症小体在此中的遗传学效应，特别是对于由多基因调控的IS来说更是如此，而探索某一疾患与多位点基因型组合之间的关联是一项重要而复杂的工程。至目前为止仅有一项关于IS与CARD8/NLRP3基因型组合间的关联性研究[25]。本文在此总结了CARD8/NLRP3基因型组合在慢性炎症性疾病中的研究概况。

类似于IS,AS及NLRP3炎症小体也参与了腹主动脉瘤的病理生理过程，2011年一项国外的研究发现[26]，基因型组合CARD8rs2043211/NLRP3rs35829419AT/CC对腹主动脉瘤的发病具有保护作用，此结论与Roberts等[27]在Crohn病中的研究结果不谋而合，Roberts等[27]发现当NOD2基因处于野生型时，基因型组合CARD8rs2043211/NLRP3rs35829419AT/CC及AA/CA对Crohn病具有保护作用，当用性别分层后，上述基因型组合在女性Crohn病患者中具有更高的频率。两位著者对此解释如下：CARD8rs2043211的小等位基因导致了过多的Pro-IL-1β的产生，一旦NLRP3rs35829419位点出现的并不是“功能获得性”的小等位，Pro-IL-1β就不能被剪切生成过多的IL-1β并释放，反之如果NLRP3rs35829419小等位基因并未与CARD8rs2043211的小等位基因同时存在，因为CARD8是非截断蛋白，就不会有过多的Pro-IL-1β的出现。由此可见当NOD2处于野生型时，CARD8rs2043211与NLRP3rs35829419的SNPs相关显著，当一个多态性位点的小等位和另一个多态性位点的野生纯合型共存时，可减少人群罹患Crohn病的风险。

上述研究的学者们评估了CARD8C10X和NLRP3Q705K的所有基因型组合，Schoultz等[28,29]将研究群体根据不存在变异的等位基因（C10X/Q705K+/+）和至少存在一个变异的等位基因(C10X/Q705K-/-)进行区分。Kastbom等[29]发现携带CARD8C10X/NLRP3Q705K-/-的RA患者疾病活性更高，更适宜接受TNF阻滞治疗。2015年同一著者团队进一步研究表明[30]，携带CARD8C10X/NLRP3Q705K-/-基因型组合的RA患者IS和短暂性脑缺血发作的易患性增加，但不增加心肌梗死及心绞痛的罹患风险。上述发现在表达NOD2基因野生型的男性Crohn病患者中被进一步证实[28],Roberts等[26,27]发现基因型组合C10X/Q705K-/-显著增加疾病进展的风险。这些研究从另一角度佐证了前述的研究结果。

为进一步了解CARD8/NLRP3基因型组合对IS，乃至对IS不同亚型易患性的影响，我科研小组历经4年的探索，发现CARD8rs2043211的AT基因型与NLRP3rs10754558的CG型在动脉粥样硬化血栓型脑梗死的发病中存在交互作用，并显著增加发病风险，而在小动脉型脑梗死人群并未发现此种关联[25]；同时实验亦证实了动脉粥样硬化血栓型脑梗死患者HsCRP的水平较小动脉型脑梗死显著增高，提示免疫炎症机制可能参与了前者的发病过程[25]。此结果进一步诠释了NLRP3炎症小体在免疫炎性机制中的遗传学效应：CARD8rs2043211的小等位基因形成终止密码Cys10Stop，因而表达丧失了抑制NF-κB激活功能的截断的CARD8蛋白，使得Pro-IL-1β的产生过多[31]，而NLRP3rs10754558的“功能获得性”小等位基因的同时存在，使得Pro-IL-1β被进一步转化为过多、成熟的IL-1β成为可能，从而导致了动脉粥样硬化血栓型脑梗死的发生。

此外，Verma等[32]曾对一例表现为严重的炎症症状、具有高水平的IL-1β并携带C10X与Q705K均为杂合型的NLRP3炎症小体基因的患者给予IL-1β受体拮抗剂治疗，其症状得到了显著的改善。所以，Kastbom等[29]认为如能证实患者所携带的基因型为C10X/Q705K-/-，便可作为选择靶向IL-1β信号转导通路治疗的依据。因此作者的探索[25]将有望协助判断可能对靶向治疗IL-1β信号通路有效的动脉粥样硬化血栓型脑梗死患者，缩短病程，缓解症状。

但是，有些研究[19,22,.33]也没有发现Q705K和C10X的交互作用对慢性炎症性疾病的发病风险有何效应，这些研究与前述研究的结果相悖，或许是缘于大部分携带C10X的人群是在C10X位点的下游启动了CARD8亚型的转录，因此仍可以表达一个稍小、功能未损的亚型（T47)[34]。Bagnall等[34]的研究揭示了一系列可能影响C10X多态性功能结果的mRNA的亚型（T48、T54、T47、T51和T60），其中，T48产生的是截断形式的CARD8蛋白，从而失去了抑制NF-κB活性的功能；T60异构体因为不能与NLRP3结合并抑制其寡聚化而失去了下调NLRP3炎症小体活性的能力[35]；而携带C10X纯合型的人群或许会由于亚型T47而拥有功能正常的CARD8蛋白[36]。所以更重要的是深入地探索已鉴定出的CARD8亚型的作用，以评价其抑制NF-κB激活的潜在能力。

小结

近10年间，NLRP3炎症小体各组分尤其是CARD8和NLRP3两基因的SNP位点间的交互作用已逐渐被科研工作者们所重视，但纵观以前的研究，其与多种炎症性疾病易感性的关联作用仍存在争议，且在IS这一领域的相关研究正处于始动阶段，还需要深入的功能研究来阐明多个基因多态性位点间的交互作用对IS的基因转录和蛋白表达的影响，这类基因间共关联作用的发现将实现精准筛查和精准防治慢性炎症性疾病（如IS和自身免疫性疾病等）。

吕洁,蒋晓山,张晶,彭湘晖,林红梅.NLRP3炎症小体组分NLRP3及CARD8基因的遗传变异与缺血性脑卒中[J].脑与神经疾病杂志,2020,28(10):645-649.

基金:广西壮族自治区桂林市科学研究与技术开发计划项目(20170109-30).