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组蛋白去乙酰化酶3抑制剂通过减轻氧化应激降低缺氧/复氧引起的PC12细胞凋亡

2021-10-08 108 上传者：管理员

摘要：目的通过鼻内针刺明确鼻黏膜的病理学变化并通过瞬时感受器电位香草酸受体1(TRPV1)-P物质(SP)轴在实验性变应性鼻炎鼻黏膜中分布及表达情况,探讨其可能的信号传导机制。方法采用卵清蛋白及氢氧化铝凝胶方法建立变应性鼻炎动物模型。25只新西兰大耳兔随机分成正常组、模型组、假针刺组、针刺外迎香组和鼻内针刺组,每组各5只。观察鼻内针刺对动物行为学、鼻黏膜病理学及动脉血中嗜酸性粒细胞(EOS)计数和IgE含量影响,采用HE染色法明确鼻黏膜EOS的分布,采用免疫组织化学方法观察鼻黏膜及TRPV1及SP的分布和表达情况。结果行为学评分结果发现,与模型组相比,假针刺组行为学计分下降不明显,针刺外迎香组和鼻内针刺组行为学计分有下降趋势,鼻内针刺组下降程度更显著。血常规中EOS计数结果显示,模型组与正常组相比,EOS计数稍增多但差别无显著性(P>0.05);鼻内针刺组与模型组相比,EOS计数有减少趋势,差别也无显著性(P>0.05)。ELISA法检测IgE发现,与正常组相比,模型组血清中IgE含量明显增多(P<0.05);与模型组相比,假针刺组血清中IgE含量未见明显变化(P>0.05),针刺外迎香组和鼻内针刺组血清IgE含量有下降趋势(P<0.05),但鼻内针刺组血清IgE含量较针刺外迎香组下降更为明显,两组差异无统计学意义(P>0.05)。HE染色结果显示,与正常组相比,模型组和假针刺组EOS浸润明显增多,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,鼻内针刺组和外迎香组EOS浸润程度减轻,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组织化学结果显示,与正常组相比,模型组和假针刺组鼻黏膜TRPV1及SP表达增多,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,鼻内针刺组和外迎香组TRPV1、SP表达明显减弱,差异有统计学意义(P<0.05)。结论鼻内针刺可以通过减少嗜酸性粒细胞在鼻黏膜的趋化及血清中IgE含量来缓解变应性鼻炎模型的鼻部症状。

关键词：
化应激反应
流式细胞术
组蛋白去乙酰化酶抑制剂
缺氧/复氧
缺血性脑卒中
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缺血性脑卒中是最常见的脑卒中类型，占我国脑卒中的69.6%～70.8%，以其高发病率、高致残率及高病死率给人类的生命造成严重威胁。缺血性脑卒中发病机制复杂，至今尚无有效的方法可完全治愈缺血性脑卒中患者[1]。组蛋白去乙酰化酶作为一类重要的染色体结构调节酶，可以使组蛋白去乙酰化与带负电荷的DNA紧密结合，致密卷曲染色质，抑制基因的转录从而参与细胞基本活动的调节[2]。在真核生物中HDACs分为4大类，18个亚型(HDAC1～HDAC18)[2]。Yang[3]和Demyanenko[4]等研究表明，HDAC3在缺血性脑损伤过程中发挥重要的作用，提示HDAC3是治疗缺血性脑卒中潜在新靶点。本研究建立PC12细胞缺氧/复氧损伤模型，探究HDAC3抑制剂RGFP966在缺血性脑卒中中的作用，初步揭示其机制。

材料和方法

1．材料与试剂

PC12细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院。FBS、青霉素+链霉素溶液、RPMI-1640基础培养基购于Gibco公司。RGFP966购自中国MCE公司;MTT细胞活性试剂盒和乳酸脱氢酶细胞毒性试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司;细胞凋亡检测试剂盒购自Roche公司;活性氧簇检测试剂盒购自沈阳万类生物科技有限公司;超氧化物歧化酶、丙二醛测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所;兔抗HDAC3多克隆抗体、兔抗剪切型Caspase-3(cleaved-Caspase-3)多克隆抗体、兔抗Bcl-2多克隆抗体、兔抗Bax多克隆抗体和兔抗GAPDH多克隆抗体及山羊抗兔HRP标记二抗购于艾博抗(上海)贸易有限公司。

2．实验方法

2.1细胞培养及分组:

将2000个对数生长期PC12细胞接种于96孔板中，放入含有1%青霉素/1%链霉素和10%FBS的RPMI1640培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。将细胞分为3组:对照组:正常条件下培养PC12细胞;H/R组:PC12先置于低糖RPMI1640培养基，置于95%N2、5%CO2、37℃的培养箱中培养4h，更换为正常培养基置于5%CO2、37℃的培养箱中培养24h，建立H/R损伤模型;H/R+抑制剂组:35nmol/LRGFP966预处理1h后，再进行H/R，每组重复3次。

2.2MTT法测定细胞活性:

:各组给予相应的处理，实验结束时，每孔加入5g/L的MTT20μl，继续培养4h，每孔加DMSO150μl，微量振荡器振荡15min后，采用自动酶标仪测490nm处吸光度(absorbance,A)值，实验重复3次。细胞存活率(%)=(A实验-A空白)/(A对照-A空白)×100%。

2.3LDH释放测定:

各组给予相应的处理，实验结束时，弃培养基，加入含10μlLDH释放试剂新鲜培养基，于37℃孵育1h,400×g离心5min，取上清液按照说明书进行测定。

2.4AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率:

各组给予相应的处理，实验结束时，各组取105个细胞加入195μlAnnexinV-FITC结合液和5μlAnnexinV-FITC，避光孵育10min，离心弃上清液，再加入190μlAnnexinV-FITC结合液和10μlPI染色液，低温避光放置10min后置流式细胞仪检测。

2.5细胞内ROS检测:

各组给予相应的处理，实验结束时，弃培养基，加入浓度为100nmol/LCFH-DA探针，孵育0.5h后，收集细胞置流式细胞仪检测。

2.6SOD和MDA测定:

各组给予相应的处理，实验结束时，收集细胞加入提取液按照说明书分别测定SOD和MDA的含量。

2.7Westernblotting测定:

各组给予相应的处理，实验结束时，收集各组细胞，分别加入RIPA裂解液并在冰上放置20min,4℃、13000r/min离心20min，采用BCA试剂盒测定上清液蛋白含量。取35μg总蛋白进行SDS-PAGE，转PVDF膜，用2%BSA封闭液封闭，加入一抗(1∶1000)4℃过夜，以GAPDH抗体为参照，再加入二抗(1∶5000)室温孵育1h。ECL曝光成像，采用AlphaImagerHP凝胶成像系统AlphaView3.0智能化图像分析软件分析结果。

2.8统计学方法

数据采用SPSS12.0统计学软件进行分析。计量资料以均值±标准差表示，多组间均值差异比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验;计数资料以百分比表示，组间的比较采用χ2检验;P<0.05为有统计学意义。

结果

1．各组细胞活性比较

MTT法检测细胞活性。与对照组相比，H/R组与H/R+抑制剂组细胞活性均显著降低(F=162.4,P<0.05),H/R+抑制剂组细胞活性高于H/R组(t=5.556,P<0.05，图1A);检测各组LDH水平，与对照组相比，H/R组与H/R+抑制剂组LDH均升高(F=770.4,P<0.05),H/R+抑制剂组LDH低于H/R组(t=20.53,P<0.05，图1B)。提示，HDAC3I增加H/RPC12细胞活性。

2．各组细胞凋亡率比较

流式检测各组细胞凋亡率。与对照组相比，H/R组与H/R+抑制剂组细胞凋亡率均显著增加(P<0.05),H/R+抑制剂组细胞凋亡率显著低于H/R组(P<0.05，图2)。Westernblotting检测各组凋亡相关蛋白水平。与对照组相比，H/R组与H/R+抑制剂组Bax、cleaved-Caspase-3均显著升高，Bcl-2显著降低(P<0.05),H/R+抑制剂组Bax、cleavedCaspase-3均显著低于H/R组，Bcl-2显著高于H/R组(P<0.05，图3)。提示，HDAC3I降低H/RPC12细胞的凋亡。

3．各组氧化应激水平比较

流式检测各组细胞ROS水平。与对照组相比，H/R组与H/R+抑制剂组ROS均显著增加(P<0.05),H/R+抑制剂组ROS显著低于H/R组(P<0.05，图4)。试剂盒检测各组MDA及SOD水平。与对照组相比，H/R组与H/R+抑制剂组MDA显著升高(F=684.9,P<0.05，图5A),SOD显著降低(F=381.4,P<0.05),H/R+抑制剂组MDA显著低于H/R组(t=21.57,P<0.05),SOD显著高于H/R组(t=10.57,P<0.05，图5B)。提示，HDAC3I降低H/RPC12细胞的氧化应激水平。

4．各组HDAC3蛋白比较

Westernblotting检测各组HDAC3蛋白。与对照组相比，H/R组HDAC3蛋白表达显著升高(P<0.05)，而H/R+抑制剂组HDAC3蛋白表达显著低于H/R组和对照组(P<0.05，图6)。提示，HDAC3I降低缺氧/复氧PC12细胞的HDAC3蛋白水平。

讨论

表观遗传修饰在多种疾病的病理生理学中起着关键作用，是当前的研究热点。组蛋白乙酰化和去乙酰化是表观遗传变化的主要参与者[5]。组蛋白乙酰化水平由组蛋白乙酰转移酶(histoneacetyltransferase,HATs)和HDACs之间的动态平衡决定。有研究表明，抑制HDACs可以改变上述平衡，并有助于增强组蛋白乙酰化、染色质松弛和基因表达，对代谢紊乱和脑血管病变等各种疾病发挥治疗潜力[6]。

HDAC3是1类HDAC家族(HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8)的成员，在包括大脑在内的几乎所有人体组织中都有表达[7]。Yang[3]和占红英[8]等研究HDAC3的表达，发现在缺血性脑卒中早期均明显升高;还有研究表明，HDAC3过表达可导致健康大鼠小脑颗粒神经元死亡，而HDAC3短发夹RNA介导的表达抑制可防止低钾诱导的神经元死亡[9]。在缺氧/缺血性脑损伤大鼠中注射伏立诺他、丙戊酸钠、普诺司他或曲古柳菌素A等HDACI，降低了HDACs活性和促炎因子白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子α及诱导性一氧化氮合酶表达，改善神经功能评分和减少脑梗死体积[10]。提示，HDAC3在缺血性脑卒中的病理损伤中发挥重要作用，降低HDAC3表达可在卒中后发挥神经保护作用。HDAC3I明显降低HDAC3表达可在卒中后发挥神经保护作用，其机制与降低卒中后的炎症反应有关。本研究发现，在建立PC12细胞H/R损伤模型前，H/R+抑制剂组采用HDAC3I预处理1h后造成H/R损伤，结果表明，与H/R组相比H/R+抑制剂组细胞活力升高，而LDH和凋亡降低。提示，HDAC3I降低PC12细胞H/R损伤，这与上述结论一致。但HDAC3I在缺血性脑卒中的具体作用机制还需进一步探究。

脑缺血后立即引发一系列的病理反应，除炎症反应外，还有氧化应激、细胞凋亡等反应，各个反应之间都是互为因果，相互联系，最终导致脑损伤以及脑死亡。目前，氧化应激已成为缺血性脑卒中研究的焦点，脑组织缺血/缺氧时，细胞内产生大量ROS，对细胞膜结构、核酸和蛋白分子产生过氧化作用，破坏膜完整性及通透性，释放多种促凋亡蛋白进入细胞质，从而下调了Bcl-2/Bax比例或者激活Caspase依赖的线粒体凋亡通路，造成缺血中心区周围(缺血半暗带)神经元凋亡。研究发现，川芎嗪、白藜芦醇、蝙蝠葛碱和羟基红花黄色A等中药均可通过清除自由基，抑制氧化应激反应拮抗细胞凋亡的保护性作用。这与本研究HDAC3I可以降低H/R损伤PC12细胞中cleaved-Caspase-3、ROS和MDA水平，提高SOD水平及Bcl-2/Bax比值的结果一致，提示，HDAC3I通过减轻氧化应激降低H/R引起的PC12细胞凋亡。